SANOTOXITEST

PROGRAMUL 4 -  Parteneriate in domeniile prioritare

DOMENIUL 5 - Agricultura, Siguranta si Securitate alimentara

Denumirea proiectului: Noi metode de evaluare a sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare si asigurarea protectiei sanitar-veterinare (SANOTOXITEST)

Director de proiect: Prof.univ.dr. Daniela Bratosin (bratosind@yahoo.com )

Numar de contract: 52121/2008

Valoare contract: 751.884,74 RON

Coordonator: Institutul National De Cercetare-Dezvoltare Pentru Stiinte Biologice, Splaiul Independentei, Nr. 296, Sector 6, Bucuresti, Cod postal 060031

Parteneri:
- Universitatea Bucuresti (P1)

- Universitatea Pitesti (P2)

- Universitatea Arad (P3)

Rezumatul proiectului:

Printre problemele majore cu care se confrunta societatea umana in prezent, doua cel putin vizeaza direct calitatea vietii si a sanatatii oamenilor, poluarea mediului si calitatea alimentaţtei, si care se gasesc intr-o dependenta directa. Stabilirea concentratiilor maxime de substante toxice admise in apele de suprafata, cunoasterea actiunii vatamatoare asupra vietii acvatice si aprecierea gradului de risc pe care il au asupra calitatii viitorului produs alimentar au devenit mai mult decat o necesitate. Pe langa testele clasice de toxicologie, cu avantajele si limitele cunoscute, se incearca in prezent gasirea unor biomarkeri moleculari capabili sa masoare riscul adus de starea de poluarea apelor, in ansamblul actiunii sinergice a agentilor poluanti, fata de organismele acvatice, repectiv fondul piscicol. Cercetarile vor fi focalizate pe identificarea efectelor produse de poluantii al caror risc si periculozitate ce nu pot fi determinate prin testele actuale fizico-chimice depasite prin limita de sensibilitate si care nu pot evidentia efectele sinergice ale acestora sau efectul cumulativ in timp. Ele vizeaza explorarea si exploatarea mecanismelor fiziologice pentru estimarea dozelor mici de factori de risc si evaluarea efectelor cumulative şi de expunere combinata la factori poluanti, dar si la efectul de lunga durata. Intregul proiect se bazează pe o conceptie absolut originala emisa de noi, potrivit careia anumiti factori poluanti, singuri sau in sinergism pot induce un fenomen de apoptoza celulara asupra anumitor tesuturi care vin in contact cu acestia. Cercetarile se vor indreapta cu prioritate asupra aprofundarii mecanismului de actiune al poluantilor asupra eritrocitelor (care sunt direct expuse poluantilor pe diferite cai, dar mai ales la nivel de branhii) si ficatului, ca principal organ ce asigura detoxifierea organismului dar si asupra tesutului muscular care constituie partea comestibila a produsului piscicol ca aliment. Proiectul isi propune investigarea fenomenului de apoptoza sub actiunea xenobioticelor asupra celor doua tesuturi, fenomen slab studiat pe plan international si inca incomplect elucidat si exploatat in favoarea civilizatiei umane. Paralel cu investigarea fenomenului de apoptoza celulara   variatia unor enzime cunoscute deja ca indicatori in ecotoxicologie precum esterazele celulare sau GST-transferaza, dar cu metodologie noua (citometrie in flux) pentru posibilitatea utilizarii ulterioare ca teste de toxicitate. Tot prin citometrie in flux se va determina influenta actiunii poluantilor asupra  b-galactozidazei, cu posibilitatea imaginarii unui alt test sensibil. Determinarea profilului proteic muscular precum si evidentierea zimografica a metaloproteinazelor matriceale in muschi sau investigarea prezentei vitelogeninului în sangele masculilor expusi la actiunea poluantilor estrogen-mimetici, vor putea conduce la imaginarea de noi metode de apreciere a sanogenezei. Cercetarile vor fi corelate cu indicatori biologici de poluare din mediul fondului piscicol analizat precum si cu analiza fizico-chimica a apei.

Obiectivele proiectului

Obiectivul major al prezentului proiect este acela de a elabora metode noi, rapide si sensibile de apreciere a securitatii produsului piscicol ca aliment pentru asigurarea protectiei sanitar-veterinare

Pentru aceasta ne-am propus urmatoarele obiective generale:

1. Identificarea efectelor produse de poluantii al caror risc şi periculozitate nu pot fi determinate prin testele actuale fizico-chimice depasite prin limita de sensibilitate si care nu pot evidentia efectele sinergice ale acestora sau efectul cumulativ in timp.

2. Explorarea si exploatarea mecanismelor fiziologice pentru estimarea dozelor mici de factori de risc şi evaluarea efectelor cumulative şi de expunere combinată la factori poluanti, dar şi la efectul de lungă durată.

3. Verificarea ipotezei ca anumiti factori poluanti, singuri sau in sinergism pot induce un fenomen de apoptoza celulara asupra anumitor tesuturi care vin in contact cu acestia: eritrocitele din sange, ficatul, ca principal organ ce asigura detoxifierea organismului dar si asupra tesutului muscular care constituie partea comestibila a produsului piscicol ca aliment.

4. Se va determina variatia unor enzime cunoscute deja ca indicatori in ecotoxicologie precum esterazele celulare sau GST-transferaza, dar cu metodologie noua (citometrie in flux) pentru eventuala posibilitate de utilizare ulterioara ca teste de toxicitate (sanogeneza).

5. Tot prin citometrie in flux se va determina influenta actiunii poluantilor asupra  b-galactozidazei, cu posibilitatea imaginarii unui alt test sensibil.

6. Determinarea profilului proteic muscular precum si evidenţierea zimografica a metaloproteinazelor matriceale in muschi precum si investigarea prezentei vitelogeninului in sangele masculilor expusi la actiunea poluantilor estrogen-mimetici, eventuali indicatori ce pot conduce la imaginarea de noi metode de apreciere a sanogenezei.

7. Identificarea unor biomarkeri capabili sa aprecieze calitatea produsului piscicol ca aliment.

8. Imaginarea unor metode, “teste”(kituri) rapide şi deosebit de sensibile, capabile sa deceleze efectul produs de cantitati mult mai fine de agenti toxici şi poluanti si in acelasi timp sa masoare efectul sinergic de actiune al acestora asupra pestelui ca produs alimentar (teste ce urmeaza a fi brevetate) pentru ameliorarea calitativa a mijloacelor de supraveghere si control a produsului piscicol ca aliment pentru obtinerea “calificativului“ de “bio” sau similar cu acesta, asigurand consumatorul de securitatea produselor cumpărate şi contribuind totodată la ameliorarea calitatii vietii si a sanatatii populatiei.

9. Dezvoltarea patrimoniului stiintific national si international, promovand astfel cercetarea romaneasca.

Etape de realizare:

Etapa I

Etapa II

Etapa III

Etapa IV

Echipamente achizitionate in cadrul contractului

• Incubator cu CO2
• Hota de aer cu flux laminar

Impactul rezultatelor obtinute:

         Obiectivul major al proiectului a constat in obtinerea unor metode noi, alternative, originale de supraveghere si control a produsului piscicol ca aliment pe baza unor rezultate obtinute anterior in cercetare.

         Rezultatele au condus  la obtinerea unor metode,  “teste” rapide şi deosebit de sensibile, capabile să deceleze efectul produs de cantităţi mult mai fine de agenţi toxici şi poluanţi şi în acelaşi timp să măsoare efectul sinergic de acţiune al acestora asupra  pestelui ca produs alimentar.

         Din totalul metodelor testate pe model de laborator prin intoxicarea unor pesti cu diferite categorii de poluanti (faza 2010) si ex vivo pe tesuturi izolate de la pesti prelevati din ape cu grade diferite de poluare, au rezultat un numar de 12 metode si 2 teste potential aplicabile dupa efectuarea unor teste statistice si standardizarea acestora.

Dintre aceste metode originale, patru se bazeaza pe citometrie in flux, metoda moderna, rapida, sensibila si statistica de analiza celulara:

1.      Protocol  (test) de apreciere prin citometrie in flux pe baza determinarii nivelului de apoptoza hepatica pentru aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare;

2.      Protocol (test) de determinare a viabilitatii celulare cu Calcein-AM pe hepatocit prin citometrie in flux pentru aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare )

3.      Metoda de analiza prin citometrie in flux directa in sistem FSC/SSC a modificarilor de morfologie si structura celulara pe hepatocit ca posibil test de sanogeneza.

4.      Metoda pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola pe baza determinarii activitatii beta-galactozidazice pe hepatocit prin citometrie in flux;

noua  sunt  metode  biochimice de analiza de spectrometrie si electroforeza:

1.      Metoda pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola pe baza determinarii prezentei vitelogenului  

2.      Metoda pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola pe baza determinarii  nivelului de glutation redus din ficat, muschi si branhii

3.      Metoda  pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare pe baza determinarii  profilului proteic muscular

4.      Metoda  pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare pe baza evidentierii zimografice a metaloproteinazelor matriceale in muschi

5.      Metoda  pt aprecierea sanogenezei produselor de origine piscicola in vederea cresterii securitatii alimentare pe baza determinarii gradului de fragmentare a ADN-ului in hepatocite prin tehnica Comet.

6.      Metoda pentru stabilirea "ex vivo"a influentei factorilor poluanti din mediul natural asupra activitatii esterazice prin spectrofotometrie

7.      Metoda pentru masurarea activitatii Glutation S-transferazei ca enzima indicatoare pentru evaluarea calitatii produsului piscicol

8.      Metoda pentru determinarea "ex vivo" a influentei factorilor poluanti din mediul natural asupra activitatii beta-galactozidazice prin spectrofotometrie

9.      Metoda pentru evidentierea fragmentarii ADN in cursul fenomenului de apoptoza "in vivo" prin electroforeza de tip Comet

si o metoda de analiza microscopica:

1.      Metoda histologica de apreciere a sanogenezei la nivel de tesuturi (ficat, muschi, branhii)

                        Aceste teste (dupa brevetare) pot constitui instrumente de analiza pentru controlul de calitate al produselor piscicole, alaturi de metodele uzuale aplicate astazi, pentru  acordarea certificatului de calitate a produsului piscicol ca aliment pentru obţinerea “calificativului“ de “bio” sau similar cu acesta si în consecinta, au un impact social, asigurând consumatorul de securitatea produselor cumpărate şi contribuind totodată la ameliorarea calitatii vietii si a sanatatii populatiei si de asemenea un impact economic major prin acordarea certificatului de calitate produsului piscicol ce se va reflecta ulterior intr-un pret mai crescut al produsului bio.

Avantajele metodelor rezultate in urma cercetarilor fata de metodele analitice de evidentiere a urmelor de poluanti in diferite tesuturi este dat de faptul ca ele pot aprecia de o maniera globala efectul cumulativ sau sinergic al diferitilor poluanti aflati in limite aproape insesizabile.

Cercetarile intreprinse, desi au avut un puternic caracter aplicativ, contribuie în egală măsură la patrimoniul ştiinţific fundamental, de toxicologie moleculara, de ecologie, iar rezultatele obţinute vor constitui baze de date pentru noi studii şi biotehnologii.

             In cadrul proiectului, pe parcursul derularii cercetarilor, a fost atras un numar de 8 doctoranzi si un masterand, impactul academic rezultand din initierea si specializarea in tehnici moderne, de analiza celulara (citometrie in flux si tehnici complementare de microscopie)  si biochimice, cu aplicare directa in toxicologie si ecotoxicologie.

De asemenea, rezultatele obtinute au fost difuzate atat in mediul academic, prin participare la manifestari stiintifice cat si prin prezentarea lor in cadrul unei scoli de vara adresata in special formarii tinerilor.

              Proiectul, prin rezultatele obtinute (metode definite si verificate la nivel experimental), deschide perspectiva continuarii unor cercetari fundamentale pentru clarificarea mecanismelor celulare ce stau la baza actiunii poluantilor cat si la standardizarea metodelor elaborate conform cu normele internationale.