Rezumatul fazei a II a

Faza II pe 2009:
” Evaluarea „in vitro” pe modele experimentale de laborator a efectului toxic si ecotoxicologic indus de nanoparticole asupra viului si crearea unui prototip de simulator”.

Termen : 30.09.2009

Rezultate prevazute a fi livrate pe etapa:
“Evaluarea toxicitatii si ecotoxicitatii unor nanoparticole in vederea validarii testelor pentru studii de nanotoxicologie in vitro.Crearea unui prototip de P-simulator”.

Rezultatele fazei:
Nanotehnologiile reprezinta un domeniu stiintific si economic inovativ, in plina dezvoltare, care poate prezenta o varietate de riscuri pentru mediul inconjurator si sanatatea umana. Nanostiinta incearca sa inteleaga materialele la nivel de nanoscala (0.1-100 nm in diametru), iar nanotehnologia cauta sa sintetizeze, sa modifice si sa manipuleze materia la acest nivel. Conform unor estimari, nanotehnologia promite sa depaseasca de departe impactul revolutia industriala si este proiectata sa devina o piata de 1 trilion de dolari in SUA in 2015. Importanta nanotehnologiei pentru societatea umana este indiscutabila, insa impactul sau potential negativ necesita o studiere mai aprofundata. Aprecierea gradului de toxicitate si poluare a mediului acvatic se impune a fi abordata cu maxima seriozitate si cu metodologii noi. O intelegere mai buna a factorilor de risc legati de nanomaterialele din corpul uman si din ecosistem va ajuta la dezvoltarea si exploatarea unei diversitati de nanomateriale.
In prezentul proiect, cercetarile noastre s-au focalizat cu prioritate pe identificarea efectelor produse de nanoparticule, pe stabilirea concentratiilor de risc pentru sanatate si mediu prin noi metode de investigare celulara bazate in special pe tehnici de citometrie in flux. In plus, pe baza conceptului emis de noi, potrivit caruia anumite tesuturi care vin in contact direct cu factori declansatori de apoptoza, cum ar fi factorii poluanti,in particular nanoparticole sau nanomateriale, pot induce un fenomen de apoptoza celulara. Eritrocitele sunt celulele care vin cu prioritate si direct in contact cu factorii poluanti la nivel de branhii si pot declansa un fenomen de apoptoza sub actiunea acestora. In plus, incercam sa aplicam si sa valorificam rezultatele originale privind conceptul de apoptoza eritrocitara atat in cazul hematiilor umane anucleate cat si nucleate de batracian, precum si testul original de determinare a viabilitatii celulare pe baza de Calceine-AM.
Pentru studiile noastre de toxicitate si ecotoxicitate in care dorim sa utilizam un nou model celular, respectiv celula eritrocitara umana (anucleata) sau cea de batracian (eritrocit nucleat), ne-am propus sa luam in studiu, doua tipuri de nanoparticole, respectiv:
A. Nanocristale de TIO2 dopate cu ioni metalici (TiO2; TiO2+Fe 0,5%;TiO2+Fe 1,5%;TiO2+Fe 2%;TiO2+Pt 0,5%; TiO2+Pt 1,5%; TiO2+Ag 0,5%; TiO2+Ag 2%; TiO2+Au 0,5%)
B. Nanoparticole pe baza de porfirine si hibrizii acestora (P1 = Meso-tetra-tolil-porfirina; P2 = Sol-gel_Meso-tetra-tolil-porfirina, cataliza acido-bazica, HCl:TEOS=0.02:1; NH3:TEOS=0.0142:1;P3 = Zn(II)-meso-tetra-piridil-porfirina;P4 = Sol-gel_Zn(II)-meso-tetra-piridil-porfirina, cataliza acida;P5 = Sol-gel_Zn(II)-meso-tetra-piridil-porfirina, cataliza acido-bazica;P6 = Meso-tetra-(3,4-dimetoxi-fenil)-porfirina meso-5,10,15,20-tetra ( 3,4 dimetoxi-fenil) porfirina;P7 = Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-porfirina, cataliza acida;P8 = Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-porfirina, cataliza acido-bazica )
Nanoparticolele si nanomaterialele corespunzatoare ne-au fost furnizate cu mare amabilitate si generozitate de Universitatea de Stiinte Agricole si Medicina Veterinara Timisoara, Prof dr. Galina Butnaru si Dr. Eugenia Fagadar de la Institutul de Chimie al Academiei Romane din Timisoara.
Diferitele tipuri de nanoparticole sau nanomateriale au fost incubate in Ser fiziologic (SF) pentru 24 de ore, in doua variante, fiind activate cu UV timp de 10 minute sau neactivate. Supernatantele au servit la obtinerea unor dilutii seriale in placi cu godeuri pentru culturi celulare, care au fost incubate pentru 20 h , la 20°C sau 37°C cu cele 3 tipuri celulare: eritrocite nucleate si anucleate precum si cu hepatocite. Concentratiile utilizate au variat intre 0,008 si 0,0005 g/ml .Deasemeni, in functie de cantitatile de nanoparticole disponibile am efectuat si o incubare directa cu cele 3 tipuri de nanoparticole pe baza de porfirine si nanomaterialele respective (8 esantioane).
Cele 2 tipuri celulare au fost analizate dupa incubare pentru investigarea efectului toxic prin analiza modificarilor de morfologie , discriminare apoptoza/necroza ,aprecierea viabilitatii celulare, urmarirea fragmentarii ADN-ului prin tehnici de citometrie in flux si metode complementare de microscopie.
REZULTATE OBTINUTE
1.2. Urmarirea efectului de apoptoza indus de diferitele tipuri de nanoparticule pe model celular de eritrocit nucleat si hepatocit prin citometrie in flux cu urmatoarele teste:1) test FSC/SSC pentru urmarirea modificarilor de morfologie; 2) test Annexina/PI; 3) test de determinare a potentialului de membrana mitocondriala cu DIOC6; 4) test de detectare a caspazelor 8 si 3 cu CaspGLOW; 5.urmarirea fragmentarii ADN-ului cu PI
1.4. Evidentierea fenomenului de apoptoza celulara indusa de nanoparticule si a testarii toxicitatii celulare pe eritrocite si hepatocite prin tehnici de imagerie
Pentru o intelegere mai usoara a rezultatelor obtinute, cele 2 activitati, 1.2 si 1.4 vor fi prezentate impreuna, dealtfel tehnicile de microscopie fiind tehnici complementare indispensabile pentru o analiza corecta prin citometrie in flux, cu corelarea informatiilor furnizate de ansamblul tehnicilor de investigare folosite.
Rezultatele din Figura 1 A , imagini de microscopie optica a hematiilor de Rana incubate in supernatantele obtinute prin preincubarea probelor de nanomateriale in ser fiziologic, dovedesc ca: a) modificarile morfologice ce se evidentiaza nu sunt uniforme pentru toate probele, nici ca intensitate, si nici ca maniera de manifestare, dovedind ca ele reflecta corect toxicitatea probabil diferita a probelor; b) acest fapt este in favoarea ipotezei noastre ca, eritrocitele nucleate pot constitui un nou model celular utilizat in aprecierea toxicitatii si probabil a ecotoxicitatii nanoparticolelor.
Modificarea morfologiei discoidale la forme rotunde, ne duce cu gandul la un fenomen de apoptoza. Ele sunt foarte numeroase la esantioanele P2 si P3, iar atunci cand ele sunt insotite de un aspect transparent, dovedesc ca aceste celule sunt moarte.
Probele P4 si P7 induc un aspect morfologic neasteptat , comparabil cu o”rotita de bicicleta” care va putea fi ulterior clarificat prin analiza TEM. Foarte interesant ca nanomaterialul corespunzator din proba P5 nu mai modifica de aceeasi maniera structura celulara, ci produce si mai bizar, un fel de “mega pori” sau “gauri” . Acelasi fenomen se observa si la proba P8, dar mai putin evident.
O prima analiza prin microscopie electronica directa, pe grila, ne da ca prima informatie o talie de aprox. 500 nm pentru acesti pori si faptul ca se pot observa la marginea celulei mitocondrii modificate, ne conduce spre un fenomen de apoptoza celulara. (Fig. 2), asa cum am optinut anterior cu inductori clasici de apoptoza.

Urmarirea efectului indus de diferitele tipuri de nanoparticule pe model celular de eritrocit nucleat si hepatocit prin citometrie in flux

Analiza modificarilor de morfologie in sistem FSC/SSC
O celula vie prezintă anumite caracteristici care vor constitui baza de evaluare a viabilitatii celulare in Citometria in flux, respectiv: talia, forma (FSC) şi refringenta (SSC), care sunt conditionate de nivelul de hidratare al celulei, de starea citoscheletului si a organitelor. Cand o celula este alterata, ea incepe sa piarda aceste caracteristici. Estimarea viabilitatii celulare prin masurarea absorbtiei si difuziei luminii, cunoscută si ca "analiza directa in sistem FSS/SSC ", (light scatter measurements) este deosebit de simpla si sensibilă. Dupa interceptarea luminii incidente, celula emite un anumit numar de semnale. Lumina difuzata sub un unghi ascutit sau in ax (FSC) poate fi corelata cu talia celulara, permitand astfel de a distinge o celula de agregate sau resturi celulare si a aprecia viabilitatea celulara, deoarece celulele moarte difuzeaza mai slab lumina in această direcţie. Lumina difuzată sub un unghi drept (SSC) permite studierea refringentei citoplasmatice, a morfologiei şi a raportului nucleo-citoplasmatic.
Modificarile de morfologie observate prin microscopie au fost corelate cu analiza prin citometrie in flux in sistem “dot-plot” FSC/SSC (talie celulara /granularitate, densitate), parametri cuantificati prin XGeoMean si YGoMean. Analizele in sistem FSC/SSC atat pentru varianta probelor activate cu UV cat si fara UV demonstreaza o perfecta corelare si evidentiere a modificarilor morfologice induse de nanoparticolele studiate asupra hematiilor nucleate de Rana, spre exemplu de P2 sau P3 din Fig.1B. Aceleasi modificari morfologice induse de nanomateriale pe hepatocite, cuantificabile prin citometrie in flux sunt evidentiate de analizele dot-plot FSC /SSC .
Estimarea viabilităţii eritrocitelor prin masurarea activitatii esterazelor intracelulare cu Calcein-AM
Din analiza comparativa a histogramelor de fluorescenta in FL1 (intensitatea de fluorescenta a Calceinei) pentru regiunile M1 (regiunea de celule viabile) si M2 (regiunea celulelor moarte) atat ca procentaje cat si ca MFI (Mean Fluorescence Intensity) din Fig. 1C se poate observa ca viabilitatea celulara este afectata de o maniera diferita, ceea ce poate fi considerat expresia toxicitatii nanomaterialelor. Din acest motiv, acest test poate fi un test de toxicitate sau ecotoxicitate, cu atat mai mult ca el permite determinarea EC50.


Figura 1.












Figura 2.

Analiza discriminativa a eritrocitelor nucleate viabile, in apoptoza sau moarte
cu Annexin-V-FITC/Propidium Iodide
Comparand % de celule ( Fig 3A) Annexin V-FITC negativ (cadranul LL) adica celule normale cu % cadranului Annexin V-FITC pozitiv (cadranul LR) continand celule in apoptoza si % cadranului UR, Annexin V-FITC pozitiv si Propidium Iodide pozitive care contine celulele moarte se constata:
1. Pentru esantionul proaspat de hematii un procent de 94,78% celule viabile, 0,82% in apoptoza si 4,2% apoptoza tarzie sau moarte, ceea ce este normal tinand cont de fenomenul natural de apoptoza si de socul primit de celule la prelevare.
2. Martorul incubat timp de 20h la temperatura camerei, care serveste de martor pentru compararea probelor incubate cu diferite nanoparticole contine aproximativ acelasi %, respectiv 94,48 % celule viabile, 4,32 % celule moarte si 4,32 % in apoptoza.
3. Pentru esantioanele incubate cu concentratii descrescatoare de nanoparticole, se constata ca % de celule in apoptoza sau necroza este proportional cu concentratia de nanoparticole sau cu natura toxica a acestora.
4. Cuantificarea apoptozei cu kitul de Annexina/PI se dovedeste astfel a fi o metoda sigura si extrem de sensibila pentru aprecierea gradului de toxicitate, si se va insista in etapele urmatoare pe exploatarea maxima a acestor markeri , cu atat mai mult cu cat ea permite calcularea EC50.
Determinarea activitatii caspazelor 8 si 3
Determinarea activitatii caspazei-8 si -3 cu ajutorul unor inhibitori specifici cuplati la un fluorocrom (IETD fmk-FITC pentru caspaza 8 si DEVDfmk-PE pentru caspaza 3), a demonstrat ca intradevar, sub influenza diferitelor nanoparticole sau nanomateriale, eritrocitele nucleate dezvolta o moarte activa, cu toate caracteristicile tipice, inclusiv activarea caspazei 8 initiatoare si mai ales a caspazei 3 efectoare (Fig. 3B si C). Acest fapt este important sub aspectul cercetarii fundamentale si va fi prezentat ulterior in articolele ce vor fi publicate, dar, sub aspectul practic urmarit de noi, respectiv de elaborare viitoare a unor noi teste, simple si eficiente, pentru determinarea toxicitatii nanoparticolelor, folosirea acestora nu prezinta calitati exploatabile.

Studiul activitatii mitocondriale
Desi TMP este un eveniment timpuriu în apoptoza, ce se reflecta prin scaderea abilitatii celulare de a acumula fluorocromi, producandu-se înainte de fragmentarea ADN-ului nuclear sau externalizarii de fosfatidilserina pe suprafata externa a membranei celulare.Analiza TMP (m) masurata cu 3,3'-dihexyloxacabocyanine iodide (DiOC6 (3)), fluorocrom cationic lipofil, permeabil prin membrana, a evidentiat ca in toate cazurile are loc o diminuare a potentialului membranei mitocondriale sub influenza esantioanelor de nanoparticole, dar aceasta este mai difícil de corelat cu toxicitatea lor, motiv pentru care, toate incercarile noastre de analiza suplimentara nu ne incurajeaza a considera acest test sensibil pentru analiza toxicitatii.

Figura 3

Urmarirea fragmentarii ADN-ului cu PI

Urmarirea fragmentarii ADN-ului cu PI s-a realizat de o maniera comparativa prin permeabilizare totala a celulelor cu Et-OH 70% sau cu produsul Citoperm de permeabilizare celulara furnizat de BD Pharmingen. In ambele situatii rezultatele nu par a pleda pentru o fragmentare celulara clasica celulelor eucariote in apoptoza, ceea ce nu exclude insa existenta unui fenomen de apoptoza particulara, in functie de natura agentului inductor si de particularitatea de structura a hematiilor de Rana sp.Detalii suplimentare vor fi obtinute prin TEM si corelate ulterior in vederea publicarii.


1.3. Stabilirea si compararea toxicitatii celulare a diferitelor tipuri de nanoparticule pe eritrocite umane cu Calcein-AM prin citometrie in flux
Utilizarea hematiilor umane pentru determinarea toxicitatii a 9 esantioane de nanocristale de TIO2 dopate cu ioni metalici (P1=TiO2; P2=TiO2+Fe 0,5%; P3= TiO2+Fe 1,5%; P4= TiO2+Fe 2%; P5= TiO2+Pt 0,5%; P6= TiO2+Pt 1,5%; P7= TiO2+Ag 0,5%; P8= TiO2+Ag 2%; P9= TiO2+Au 0,5% a confirmat ipoteza noastra, ca acest tip celular, care nu necesita conditii speciale de cultura, cum este cazul altor celule, poate fi un nou model celular. In plus, pentru intelegerea fenomenului, testul de viabilitate a fost corelat cu estimarea modificarilor de morfologie celulara prin măsurarea absorbţiei şi difuziei luminii si cu discriminarea intre apoptoza si necroxa cu AnnexinV-FITC si PI. Se observa ca in cazul unor nanocristale cu toxicitate mare, apare o liza totala a hematiilor , cum este cazul probelor P2, P3 si P7. Dintre probele care nu au produs liza: P1 prezinta 24,84% celule viabile cu un MFI de 246,95; P4 are 28,06% celule viabile si un MFI de 192,31;P5 prezinta 49,01% celule viabile cu un MFI de 185,65; P8 prezinta 22,08 % celule viabile cu un MFI de 189,27; P9 are 52,4% celule viabile si un MFI de 214,65. probabil lizei hematiilor batrane circulantecare sunt mult mai sensibile.





Figura 4.

In concluzie, se observa o buna corelare a rezultatelor obtinute prin aplicarea celor 3 metode de studiu prin Citometrie in flux, care au indicat o toxicitate foarte mare pentru esantioanele 2, 3 si 7, cu liza hematiilor. Esantionul 5 pare a fi cel mai putin agresiv fata de eritrocite, dupa cum demonstreaza
rezultatele obtinute la cele 3 metode aplicate., urmat de probele 4 si 3. Aceste probe nu au indus modificari de morfologie eritrocitara, au prezentat o viabilitate buna si o capacitate scazuta de inducere a apoptozei. Probele 9 si 8 au indus modificari morfologice de imbatranire celulara, in special pentru proba 8 unde apare si o subpopulatie de membrane eritrocitare, datorate cel mai probabil unui usor fenomen de liza.
1.5. Definirea modelului de regresie (non)liniara al apoptozei, in funcţie de diferitele tipuri de nanoparticule testate (se vor utiliza rezultatele experimentale)
A fost selectat un set de modele lineare si neliniare ce vor fi utilizate, candidate pentru analiza sistemica a datelor in fazele urmatoare, utilizabile apeland la un soft specializat. A fost definit modelul multiplicativ si s-a realizat analiza factorială pentru acest model. Variabilele independente ale celor două modele utilizate au fost diferitele tipuri de nanoparticole.
Utilizarea concentraţiilor prestabilite are un mare avantaj: permit discretizarea poluanţilor (nanoparticulelor) cu 3 avantaje importante: 1) posibilitatea modelării dependenţelor.neliniare ; 2) posibilitatea utilizării unor scheme clasice de planificarea experienţelor (experimental design); 3) posibilitatea utilizării unei clase foarte largi de modele liniare de interpretare a rezultatelor (printre care ANOVA şi ANCOVA). S-a avut in vedere si o abordare diferită , respectiv regresia logistica, un model de clasificare in doua clase.
1.6. Elemente de modelare probabilista si de tip P-systems pentru membranele biologice
Metodologia P systems s-a aplicat la efectul nanoparticulelor asupra celulelor si s-au obtinut rezultate de simulare care au fost apropiate de datele de laborator.
Am aratat ca noua tehnica de simulare este diferita atat de ODE cat side Gillespie, de pilda cele doua exemple considerate in lucrarea in care se raporteaza aceste rezultate arata ca in cazul Lotka-Voltera NWT cu memorie se apropie de ODE pentru ca oscileaza continuu, dar in cazul unor ritmuri circadiene ne apropiem mai mult de Gillespie decatde ODE care nu oscileaza decat o data.
1.7. Definirea unei noi metodologii de simulare bazata pe modele de tip P –systems, extinderea modelului teoretic de apoptoza si crearea unui prototip de P-simulator
S-a imbunatatit noua metodologie de simulare a cascadelor de reactii bazata pe P sisteme. Aceasta noua tehnica de simulare, ce preia rezultate recente de calculabilitate de tip membrana, completeaza metodele clasice de simulare celulara folosite pe plan mondial (utilizarea ecuatiilor diferentiale - ODE sau modelarea proceselor stochastice – algoritmul Gillespie).
In raport cu tehnica ODE ce presupune implicit existenta unui aspect de “continuitate” in evolutie, metoda pe care o propunem este semnificativ diferita prin utilizarea unei matematici pe discret.Subliniem faptul ca aceasta ultima abordare este sustinuta de prezenta, la nivel celular, a unor fenomene de natura “discreta”.Astfel multe cascade de reactii (signal transduction pathways) la nivelul sub-celular au numere mici de multiplicitati pentru moleculele/proteinele sau complexele de proteine formate, fapt ce ar impune cu prioritate o simulare “discreta” si mai putin una“continua”. Spre deosebire de procedura clasica de simulare folosita de Gillespie, procedura P-system are avantajul ca este cu mult mai rapida si, in plus, permite tratarea diferentiata a unor “grupuriminoritare” de celule. Acest aspect are o importanta deosebita din punct de vedere practic (de ex. la simularea perioadei de latenta in celulele infectate cu HIV), cu atat mai mult cu cat foarte recent se incearca utilizarea nanoparticulelor in maladia Sida.
In concluzie, investigarea in vitro a toxicitatii si ecotoxicitatii unor nanoparticole prin metode moderne, rapide si sensibile de citometrie in flux bazate pe biomarkeri celulari de apoptoza si de viabilitate celulara (unele dintre acestea fiind metode originale), complectate cu tehnici complementare de imagerie, a condus la obtinerea unor rezultate noi, originale, ce pot contribui la intelegerea riscului potential al nanoparticulelor pentru sanatate si mediu inconjurator.