Utilizarea nanoparticolelor pentru aplicatii biologice si medicale a cunoscut in ultimii ani o crestere rapida iar intelegerea potentialului lor toxic si a efectelor induse asupra organismului devine cruciala inainte de utilizarea lor clinica. Determinarea ecotoxicitatii acestora reprezinta deasemeni o arie larga de investigatie. Pana in prezent cele mai folosite sisteme de culturi celulare pentru testarea citotoxicitatii sau ecotoxicitatii, au fost de origine non-umana. Pentru evaluarea citotoxicitatii noi am dezvoltat un nou model celular exprimental pe baza de eritrocite nucleate de pesti sau batracieni, care sunt direct expuse la nanoparticole sau nanomateriale absorbite pe diferite cai si am evaluat efectul toxic produs prin analiza de citometrie in flux. Recent am demonstrat ca moartea celulara programa a eritrocitelor nucleate este un mecanism apoptotic (Bratosin et al., Biochimie, 86, 183-193, 2004), iar pentru evaluarea interactiilor celula-nanoparticole sau nanomateriale, eritrocitele nucleate au fost expuse la diferite concentratii de manomateriale pe baza de porfirine si analizate dupa 24h de incubare, prin citometrie in flux, pentru modificarile de morfologie (FSC/SSC), apoptoza/necroza (FITC-annexin-V/PI) si viabilitate celulara determinata cu Calcein-AM pe baza unui test original (Bratosin et al., Cytometry A, 66A, 78-84, 2005). Au fost utilizate, deasemeni tehnici complementare de microscopie optica si electronica.
Rezultatele cele mai semnificative obtinute in proiect demonstreaza ca analiza viabilitatii si mortii celulare pentru eritrocitele nucleate (de pesti sau batracieni) supuse efectului unor nanoparticule sau nanomateriale porfirinice (8 esantioane), poate constitui un nou model celular experimental, usor de utilizat si care nu necesita cheltuieli de cultura si intretinere. La fel de relevante sunt si rezultatele care demonstreaza utilitatea si sensibilitatea metodelor de citometrie in flux utilizate (determinarea viabilitatii celulare cu Calceina-AM si a mortii celulare cu Annexina /PI), metode rapide, sensibile, statistice si cuantificabile, care pot deveni noi teste brevetabile pentru domeniul nanotoxicitatii.
Investigatiile efectuate pe fibroblasti pentru studierea toxicitatii nanoparticolelor si o eventuala internalizare a lor in celula, au furnizat rezultate de toxicitate comparabile cu cele obtinute pe eritrocitele nucleate, ceea ce valideaza modelul eritrocitar, si in plus au evidentiat atat internalizarea cat si aderarea acestora la suprafata celulara (Figura 1). Deosebit de important este si faptul ca, daca toxicitatea nanoparticolelor sau nanomaterialelor se manifesta in cazul eritrocitelor nucleate prin inducerea unei morti celulare de tip apoptotic, pe fibroblasti aceastea au indus o moarte predominant de tip necrotic, ceea ce demonstreaza ca mecanismele de actiune depind de tipul celular asupra carora actioneaza.
Figura 1. Analiza pe fibroblasti a toxicitatii si internalizarii nanoparticolelor prin citometrie in flux si microscopie optica. A- Analiza modificarilor de morfologie prin microscopie optica; B- Analiza modificarilor de morfologie prin FSC/SSC; C-Analiza mortii celulare (apoptoza/necroza); D-Analiza viabilitatii celulare cu Calcein-AM (B,C si D- analize prin citometrie in flux)
In particular, rezultatele de toxicitate obtinute pe cele 8 esantioane de nanoparticole si nanomateriale ce au servit ca model de studiu si care au demonstrat comparativ ca autoxicitate diferita, vor servi de baza stiintifica pentru dr. Eugenia Fagadar, in vederea valorificarii lor tehnologice sau in aplicatii biomedicale, precum si la modigficarea tehnologiilor de obtinere. Rezultatele obtinute pivind impactul nanomaterialelor asupra organismelor acvatice confirma ipoteza de lucru si valideaza utilizarea eritrocitelor nucleate de pesti sau batracieni ca baza pentru noi teste de ecotoxicitate in vitro, dar si mai important, in vivo, deoarece la nivel de branhii se exercita un puternic efect toxic ce poate fi explorat prin investigarea citometrica a viabilitatii hematiilor. Toate rezultatele experimentale au servit deasemeni pentru o analiza statistica si pentru simularea unor fenomene celulare la nivel de membrana, in particular in inducerea fenomenului de apoptoza. Toate rezultatele obtinute si mentionate, sunt rezultate originale, noutati pe plan international ce vor fi exploatate prin publicatii stiitifice ISI. Noul model celular utilizat (eritrocitul) poate constituie baza stiintifica a unor bioteste de toxi- si ecotoxicitate prin citometrie in flux ce pot fi brevetate, dupa testari prevazute in anul urmator. S-a asigurat o contributie si participare importanta a tinerilor la cercetare (2 tineri) si formarea acestora, o parte din rezultate facand obiectul unei lucrari de licenta.
Romana | 
English
