Programul AGRAL: CERCETARI PRIVIND OBTINEREA SI ASIGURAREA CALITATII UNUI PRODUS ENZIMATIC DE UZ ZOOTEHNIC IN VEDEREA INDEPARTARII FACTORILOR ANTINUTRITIONALI

Program AGRAL

Subprogram: 4 – ZOOMED

Nr.contract: 280/01.09.2004

 

Titlul proiectului: “CERCETARI PRIVIND OBTINEREA SI ASIGURAREA CALITATII UNUI PRODUS ENZIMATIC DE UZ ZOOTEHNIC IN VEDEREA INDEPARTARII FACTORILOR ANTINUTRITIONALI”

 

 

CONDUCATOR PROIECT:

INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU STIINTE BIOLOGICE BUCURESTI -INCDSB, cu sediul în localitatea BUCURESTI, str. Spl. Independentei, nr 296, sector 6, codul po]tal 060031 CP 17-16, telefon 2207909, fax 2207695, inregistrat la Registrul Comertului sub nr.J.40/189/1997, e-mail: manon@dbio.ro, reprezentata prin Directorul General: Dr. MANUELA ELISABETA SIDOROFF si Director economic Ec. VLADIMIR SANDRU.

Director proiect: Dr. Tcacenco Luminita.

 

Partener 1:

Centrul de Biotehnologii Microbiene (BIOTEHGEN) cu sediul in Bucuresti, Str.Marasti 59, sectorul 1, cod postal 011464, telefon: 021/224 25 76/269, fax: 021/2242815,

e-mail: stefana@yahoo.com, pe baza actului de constituire nr. 377/21.02.2002, cod fiscal R146906, reprezentat prin Director Prof. Dr.Stefana Jurcoane si Director economic ec. Florentina Valimareanu, Responsabil proiect: Pr. univ. dr. Jurcoane Stefana.

 

 

Partener 2:

Institutul de Biologie si Nutritie Animala (IBNA) BALOTESTI, cu sediul in Balotesti, Calea Bucuresti nr.1, cod postal 011464, judetul Ilfov telefon/fax:021/222 44 10,

 e-mail: ibna@pcnet.ro,  pe baza actului de constituire Lg.290/2002, OG78/2003, HG 147/2004, cod fiscal R 2785651, reprezentat prin Director General Dr.Doina Valentina Grossu si Contabil sef ec. Elena Precob, Responsabil proiect: Dr. Dihoru Alexandrina.

 

BUGET:

Valoare totala proiect: 220.000 RON

Valoare buget: 170 000 RON

Cofinantare: 50 000 RON

 

3. OBIECTIVE PROIECT:

           

Obiectivele principale ale proiectului:

 

Obtinerea unei tulpini de Aspergillus niger cu activitate hidrolitica ridicata, pentru amidon, proteine, pentozani.Valorifica experiente dobindite de specialistii implicati in proiect privind selectarea de tulpini de Aspergillus niger prin tehnici deja studiate si realizate, in vederea maririi productivitatii enzimatice peste valorile comunicate in strainatate, care se situeaza la un nivel scazut.

Tehnologie de laborator privind obtinerea unui produs enzimatic cu activitate hidrolitica ridicata din Aspergillus niger.

            Stabilirea parametrilor optimi de biosinteza ai produsului enzimatic din Aspergillus niger este deosebit de importanta, cu atit mai mult cu cit reprezinta date ce nu au fost comunicate decit partial, de firmele se specialitate din strainatate.

Cresterea stabilitatii la depozitare si in general, a preparatului enzimatic prin tehnici de imobilizare pe suporturi biocompatibile.

Reprezinta o noutate, atit pe plan national cit si international, intrucit utilizarea enzimelor imobilizate pe suporturi biocompatibile in furajarea animalelor este o directie neabordata inca. Experienta in acest domeniu a specialistilor implicati in proiect  permite largirea gamei pentru acest tip de bioproduse.

Testarea produsului enzimatic in hrana animalelor de ferma, stabilirea dozei optime, evaluarea efectelor tehnico-economice, intocmirea documentatiei de realizare a furajului a schemei si a procedurii de evaluare a conformitatii.

Utilizarea atit in tara noastra, cit si in strainatate a aditivilor enzimatici in vederea maririi digestibilitatii furajelor se face inca la scara redusa, studiile statistice indica insa faptul ca in viitor vor avea o dezvoltare foarte mare.

 

 

4. Fazele proiectului:

Faza 1 –Cercetari de laborator privind obtinere de culturi de Aspergillus niger  cu  activitate hidrolitica ridicata (2004).

FAZA  2-Cercetari privind determinarea parametrilor de biosinteza a produsului enzimatic cu activitate hidrolitica din Aspergillus niger  (2005).

FAZA 3- Cercetari privind imbunatatirea calitatii produsului enzimatic prin tehnici de imobilizare (2005).

FAZA 4 - Cercetari privind evaluarea actiunii produsului enzimatic obtinut in furajarea unor animale de ferma (2006).

 

5.      ECHIPA DE CERCETARE:

 

INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU STIINTE BIOLOGICE - INCDSB-BUCURESTI

 

Dr. TCACENCO LUMINITA - Director proiect

Dr. BRATOSIN DANIELA – participant

Dr. POMPONIU DANIELA – participant

Dr. IORDACHEL CATALIN – participant

BERTEANU ELENA – participant

TANTAGOI OLIVIU – executant

BOTEZATU AURICA – executant

ENACHE MIHAELA – executant

MIHAILEANU ADINA – executant

GEANTA MARIANA – executant

DINU ECATERINA – executant

 

Centrul de Biotehnologii Microbiene (BIOTEHGEN)

 

Prof. univ. dr. JURCOANE STEFANA - RESPONSABIL PROIECT

Prof. univ. LUPESCU IRINA-  participant 

CONSTANTINESCU DIANA GABRIELA - participant

DIGUTA FILOFTEIA CAMELIA - participant

 

Institutul de Biologie si Nutritie Animala (IBNA), BALOTESTI

 

Dr. DIHORU ALEXANDRINA - RESPONSABIL PROIECT

HEBEAN VERONICA – participant

HABEANU MIHAELA – participant

NEAGU MARIUS – participant

VASILOVICI ALEXANDRINA – participant

 

6.  Cv-uri anexate ( in pagina web se va face trimiterea!!!)

 

 

 

 

7. REZULTATE:

 

Odata cu integrarea in UE in anul 2007, Romania se va alinia la Standardele Europene in ceea ce priveste asigurarea calitatii nutreturilor cu un impact deosebit asupra sanatatii animalelor si in consecinta a oamenilor, se vor interzice utilizarea pulberilor de origine animala in furajarea animalelor si prin urmare se vor cauta alte cai pentru ca necesarul de proteina furajera sa fie acoperit. In cadrul acestor surse noi de proteina intra:

·         Surse semineconventionale, cum sunt proteinele semintelor de oleaginoase (soia) si din concentratele de peste, utilizate curent astazi in diferite tari ale globului;

·         Surse neconventionale, cum sunt proteinele furnizate de microorganisme: mucegaiuri, bacterii, drojdii, alge.

Utilizarea suplimentelor enzimatice in dieta animalelor este tot mai dinamica prin numeroasele avantaje ce prezinta si anume indepartarea si distrugerea factorilor antinutritionali, conferind o mai buna biodisponibilitate anumitor nutrienti inferiori, reducerea efectului poluant al dejectiilor animaliere si nu in ultimul rand in imbunatatirea calitatii furajelor.

Reziduurile agricole grosiere (paie, coceni de porumb) pe langa faptul ca sunt utilizate in hrana animalelor pentru a asigura cerintele in energie si in substante nutritive, pot fi utilizate si ca surse de carbon in procesele de biosinteza a fungilor.

            Din literatura consultata a rezultat faptul ca majoritatea producatorilor de enzime  hidrolitice utilizeaza tulpini de Aspergillus niger si Trichoderma viride cultivate pe diferite substraturi naturale, in sistem submers sau in culturi de suprafata.

Pe baza datelor de literatura si a experientei colectivului de cercetare s-au testat in vederea obtinerii de tulpini cu activitate polihidrolitica (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze) urmatoarele tulpini existente in colectia de Microorganisme a Facultatii de Biologie-Bucuresti:

-          Aspergillus niger CBM-1;

-          Aspergillus niger CMGB-401;

-     Trichoderma viride CMGB-405;

Aceste microorganisme au capacitate de a produce in general un complex enzimatic hidrolitic ofera mai multe avantaje fata de sursele de enzima de origine animala sau vegetala, datorita  posibilitatilor de a se dezvolta si produce enzime pe medii de cultura ieftine, in instalatii speciale.

Folosirea microorganismelor ca principala sursa de enzime se datoreaza faptului ca se pot obtine cantitati mari de biomasa in timp relativ scurt si in conditii bine controlate, cat si faptului ca se pot realiza nivele enzimatice crescute prin interventii asupra mediului de cultura si a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismului in procesele fermentative fie in sistem submers, fie pe substraturi solide.

In scopul determinarii conditiilor optime pentru biosinteza enzimelor hidrolitice microbiene,  au fost analizati mai multi parametrii care au importanta semnificativa pentru dezvoltarea unei culturi microbiene. Alaturi de tulpina microbiana si compozitia mediului de cultura, printre factorii importanti se numara temperatura, pH-ul mediului de cultura, precum si gradul de agitare a mediului de biosinteza a enzimelor hidrolitice.

Ca urmare, in cadrul proiectului s-au efectuat:

ü  Realizarea modelului experimental prin stabilirea parametrilor de cultivare a microorganismelor Aspergillus niger selectat. 

ü  Experimentarea metodelor de izolare si caracterizare a produsului polienzimatic

ü  Experimentarea obtinerii preparatului enzimatic cu activitatea hidrolitica superioara din Aspergillus niger in bioreactor de 10 l.

Astfel pentru stabilirea parametrilor optimi de biosinteza a microorganismului Aspergillus niger pe mediul selectat  s-a studiat:

ü  Influenta temperaturii de cultivare asupra procesului de biosinteza a tulpinii  Aspergillus niger selectate

ü  Influenta pH-ul mediului de cultura asupra procesului de biosinteza a tulpinii  Aspergillus niger selectate

ü  nfluenta gradului de agitare asupra procesului de biosinteza a tulpinii  Aspergillus niger selectate.

          Tulpina Aspergillus niger CMGB-401 luata in lucru a fost intretinuta prin treceri succesive pe mediu inclinat Czapeck–Dox. Pe mediu Czapeck-Dox si la temperatura optima de dezvoltare de 28°C dupa 7 zile, pe suprafata mediului se formeaza un miceliu bogat alb pufos si un miceliu aerian purtator de conidiofori colorati in negru intens. Miceliul este uniform sporulat pe toata suprafata. Tuburile in care tulpina este dezvoltata corespunzator, se pastreaza in frigider la +4°C - constituind cultura de intretinere.

Lucrarile de laborator au fost efectuate - la nivel de flacoane agitate - in vederea optimizarii mediului de cultura in scopul obtinerii unui nivel cat mai mare al activitatii polienzimatice in mediul de fermentatie. Intr-un bioproces au loc simultan o serie de evenimente complexe influentate de o multime de factori interni si externi: concentratia compusilor din mediul nutritiv si concentratia produsilor biosintezei, pH-ul mediului supus fermentatiei si temperatura acestui mediu, conditiile de aerare si agitare.

           Temperatura mediului in care are loc procesul de biosinteza a enzimelor hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. Variatiile de temperatura au efect asupra randamentului de transformare a substratului in produsul finit, asupra cerintelor nutritive ale microorganismului si compozitia biomasei obtinute si, nu in ultimul rand, asupra vitezei de crestere microbiana.

           Pornind de la aceste considerente teoretice, tulpina luata in lucru, Aspergillus niger CMGB-401 a fost cultivata pe mediul optim de biosinteza folosind o cantitate de 50 ml mediu/ balon de 100 ml, inoculat cu suspensie de spori, durata procesului de fermentatie fiind de 48 ore, iar pentru dezvoltare, culturile au fost mentinute la temperaturi diferite: 28°C, 32°C, 37°C.

Atat pe parcursul biosintezei, cat si in finalul procesului de fermentatie s-a evaluat activitatea enzimatica a complexului extracelular (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze).

           Pentru determinarea pH-ului optim de dezvoltare a fungului Aspergillus niger CMGB-401 s-au efectuat experimente de biosinteza a complexului enzimatic, in intervalul de pH=5-7,5, timp de 48 de ore, la 28°C; s-a urmarit evolutia bioprocesului prin determinarea activitatilor enzimatice (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze) in conditiile metodelor de analiza, stabilite in prima etapa.

           In ceea ce priveste influenta gradului de agitare asupra procesului de biosinteza a tulpinii Aspergillus niger experimentele s-au realizat cu ajutorul unui agitator rotativ, mediul de biosinteza insamantat a fost pus in 2 flacoane Erlenmayer de 100 ml cu cate 50 ml/flacon si s-a urmarit influenta gradului de agitare dupa 48 ore de cultivare la 50, 100, 220, 250 r.p.m.. comparativ cu o proba martor neagitata.

           Indiferent de localizarea produselor de biosinteza intra- sau extracelular, prima etapa de prelucrare post-biosinteza a mediilor de fermentatie consta in separarea biomasei. Datorita volumelor mari, a vascozitatii relativ mari si a filtrabilitatii de obicei reduse a mediilor de cultura, in procesele industriale de obtinere a enzimelor hidrolitice de biosinteza se folosesc tehnici de filtrare speciale (filtre rotative cu suprafata mare).

           Pentru a reduce pierderile de substanta activa prin denaturare termica, mediile de cultura se racesc la 5-10°C si apoi se pregatesc pentru filtrare.

           S-au testat urmatoarele variante de izolare si caracterizare a produsului polienzimatic obtinut prin cultivarea tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediile de cultura luate in lucru:

ü  Prin cromatografie de adsorbtie pe CaCO₃ ;

ü  Centrifugare si concentrarea supernatantului;

ü  Filtrare si concentrarea filtratului obtinut.

                      O prima varianta a fost prelucrarea integrala a mediului de fermentatie final (50 ml) inainte de sporulare prin adsorbtie pe CaCO₃ (5 g) in curent de aer, la temperatura de 37°C, timp de 2 ore rezultand un preparat polienzimatic brut care a fost analizat ulterior.

           Procesul de filtrare al masei celulare este legat in majoritatea cazurilor de dificultati tehnologice. Centrifugarea se realizeaza cu ajutorul separatoarelor centrifugale de turatie mare de (4000 - 5000 r.p.m.).

           S-a experimentat astfel obtinerea preparatului polienzimatic cu activitate hidrolitica superioara din Aspergillus niger in bioreactor de 4 litri.

     Linia de lucru stabilita la nivel de micropilot cuprinde urmatoarele etape:

ü  Obtinerea preinoculului ca material de insamantare a mediului de bioproces;

ü  Procesul de fermentatie propriu-zis a microorganismului luat in lucru;

ü  Urmarirea parametrilor de cultivare pe parcursul procesului de fermentatie.

           Pe parcursul bioprocesului s-a efectuat controlul analitic analizandu-se:

ü  mentinerea puritatii culturii microbiene si stadiile de dezvoltare a acesteia prin efectuarea de preparate microscopice intre lama/lamela;

ü  evolutia pH-ului in timp;

ü  determinarea activitatilor enzimatice la 24 de ore si la 48 de ore (finalul procesului de fermentatie);

ü  s-au notat rezultatele finale;

ü  la finalul bioprocesului s-a prelucrat mediul de fermentatie.

          S-au definitivat metodele de dozare a activitatii hidrolitice a preparatului enzimatic din Aspergillus niger in vederea obtinerii de date reproductibile pentru activitatea amilolitica, celulozolitica, proteolitica si xilanazica.

     Rezultatele obtinute au permis alegerea temperaturii optime de cultivare, temperatura la care activitatea celor 4 enzime din complex se situeaza la valori ridicate, aceasta fiind de 28⁰ C. In ceea ce priveste valoarea optima a pH-ului a fost de 5,5. De asemenea, agitarea optima a fost de 220 r.p.m,, comparativ cu proba martor unde s-a constat sporularea microorganismului, lucru recomandabil in cazul obtinerii de preparate furajere intrucat prelucarea integrala prin absorbtie pe carbonat de calciu a mediului de fermentatie dupa 48 de ore a fost abandonata; se observa o scadere semnificativa a activitatilor enzimatice datorita probabil denaturarii  termice a enzimelor hidrolitice obtinute.

     La nivel de bioreactor activitatile enzimatice ale  produsului polienzimatic, dupa 48 de ore au fost urmatoarele:

ü  Activitatea amilolitica             - 220.8 U_DNS/ml

_ü    Activitatea proteolitica - 1.98 UP/ml

ü  Activitatea celulozolitica - 4.05 (C₁-C_x) U/ml

ü  Activitate xilanazica  - 1366. 33 U/ml

          Ulterior, mediul de fermentatie, dupa 48 de ore a fost supus proceselor de izolare si caracterizare a enzimelor hidrolitice, iar produsul polienzimatic obtinut prin filtrare, concentrare si adsorbtie pe CaCO₃ prezinta urmatoarele activitati enzimatice:

ü  activitate amilolitica – 105,36 U_DNS/g

ü  activitate proteolitica – 1,08 UP/g

ü  activitate celulozolitica – 1,354 U/g

ü