PN II 62059 FAZA III/2010

Includerea componentelor biologic active in lipozomi nanostructurati. Caracterizarea fizico-chimica si biologica.

Obiective  planificate: Caracterizarea structurala, ultrastructurala si biochimica a componentelor obtinute. Testarea biocompatibilitatii variantelor de componente in culturi de celule. Selectarea variantelor optime

Activitati planificate: Includerea componentelor biologic active in nanostructuri lipidice.                                              Caracterizarea biochimica si structurala a biopolimerilor si a sistemelor lipozomi-componente biologic active. Evaluarea biocompatibilitatii in vitro a biopolimerilor si a sistemelor lipozomi-componente biologic active. Diseminarea rezultatelor. Managementul proiectului.

Rezultate obtinute:

Activitatile de cercetare din cadrul prezentei faze de cercetare au fost desfasurate de CO, in colaborare cu P1, P2, conform obiectivului propus si planului de realizare a proiectului astfel:

Ø  In vederea includerii compusilor biologic activi (glicozaminoglicani, polifenoli, polizaharide vegetale) in lipozomi s-au obtinut structuri lipidice veziculare de tip unilamelar, cu dimensiuni mici, din structuri multilamelare prin optimizarea metodei avand ca etape: evaporarea, sonicarea, cromatografia de cernere moleculara, centrifugarea. Metoda selectata reduce timpul de lucru si conserva structura bistratului lipidic. Sistemul lipozomal pozitiv PC:DOPE:CHOL:SA  (fosfatidilcolina: fosfatidiletanolamina: colesterol: stearilamina) cu raportul molar intre lipide 6:1:2:1 a inclus cea mai mare cantitate de componente biologic active. Randamentul de includere pentru CS a fost de 92%, pentru polifenoli arnica 76%, polizaharide arnica 87% si de 82% pentru polifenoli urzica.

Ø  Caracterizarea compusilor biologic activi s-a realizat prin determinarea activitatii antioxidante utilizand metoda DPPH si evaluarea citotoxicitatii intr-o cultura de fibroblaste prin doua metode: rosu neutru (evaluarea celulelor vii) si masurarea enzimei LDH, care cuantifica integritatea membranei celulare. Metodele au permis selectarea concentratiilor optime de probe, respectiv 50µg/mL pentru polifenoli arnica, 500µg/mL pentru polifenoli urzica si 0.5µg/mL polizaharide arnica.

Ø  Componentele biologic active, la concentratiile mai sus mentionate, incluse in lipozomi au fost evaluate fizico-chimic in vederea determinarii activitatii lor antioxidante comparativ cu lipozomii simpli prin metoda oxidarii lipidice. Rezultatele obtinute in urma experimentului, au aratat ca proba L-pf arnica prezinta cea mai mare activitate antioxidanta (46.4%), urmata fiind de probele L-pz arnica (35.4%), L-pf urzica (26.6%) si L-CS 10mg/mL (27.2%). Toate probele au avut activitate antioxidanta mai mare decat proba de lipozomi (24.4%) .

Ø  Analiza distributiei componentelor in sistemele lipozomi-componente biologic active s-a realizat prin metode histochimice care au evidentiat o distributie omogena a lipozomilor, a polizaharidelor si a polifenolilor inclusi in nanostructuri.

Ø  Stabilitatea sistemelor lipozomi-compusi biologic activi s-a urmarit aspectul si morfologia veziculelor lipozomale timp de 60 de zile. Cea mai mare stabilitate (peste 60 de zile) a prezentat-o proba lipozomi-CS, urmata de lipozomi-polizaharide arnica (54 zile) si lipozomi-polifenoli arnica (38 zile).

Ø  Condrocitele au fost izolate din cartilaj articular normal prin tratament secvential enzimatic (cu hialuronidaza, tripsina si colagenaza) si caracterizate din punct de vedere al morfologiei prin microscopie optica. Celulele stem mezenchimale izolate prin digestie enzimatica din pulpa dentara umana prezinta fenotip de MSC demonstrat prin: morfologia caracteristica (fibroblast-like), formarea de colonii (CFU-F), prezenta markerilor de suprafata specifici (CD90, CD105).   Diferentierea MSC in linie condrocitara (prezenta markerului specific pentru condrocite-COL II) s-a realizat folosind factori de diferentiere condrocitari. Acest model de izolare a MSC umane din pulpa dentara prezinta o serie de avantaje: limiteaza aspectele etice pentru obtinerea probelor biologice si exista o disponibilitate mai mare de tesut din extractiile dentare.

Ø  Testarea viabilitatii condrocitelor in prezenta probelor studiate comparativ cu martorul de cultura a evidentiat ca toate variantele lipozomi-compusi biologic activi si lipozomi simpli au fost biocompatibile (viabilitate celulara mai mare de 96%, morfologia celulelor normale). Studiile imunocitochimice au indicat ca sistemele L–CS se ataseaza de membrana plasmatica si ulterior sunt internalizate in celule.

Ø  Analiza in vitro a capacitatii antiinflamatoare a sistemelor lipozomi-compusi biologic activi s-a realizat pe un model experimental ce utilizeaza peroxidul de hidrogen pentru inducerea de leziuni condrocitelor. S-au folosit doua protocoale experimentale pretratament (celulele au fost tratate cu probele de interes si dupa 24h de incubare s-a adaugat H₂O₂ 0.05mM) si cotratament (celulele au fost tratate simultan cu probele de interes si H₂O₂ 0.05mM). Studiind comparativ rezultatele obtinute spectrofotometric si morfologic prin cele doua protocoale s-a evidentiat ca celulele au fost mai bine protejate de efectul inflamator al peroxidului de hidrogen in cazul pretratarii cu probele lipozomi-compusi biologic activi. Cel mai bun efect citoprotectiv l-au prezentat probele L-pf arnica (84.82%) si L-CS (83.40%). Sistemele L-pf urzica au asigurat o protectie de 80,7%, L-pz arnica de 80,9% iar L simpli de aproximativ 80%.

                Articole stiintifice

·          Zarnescu O., Moldovan L., Trif M., Moisei M., Craciunescu O., 2010, Light and electron microscopy characterization of a collagen-liposomes-entrapped chondroitin sulphate composite as intra-articular drug delivery system, Book Symposium on Innovative Polymers for Controlled Delivery 14-17 sept 2010, Suzhou, China, ISBN 978-7-81137-581-7, J. Feijen & Z. Zhong, eds., pp. 288-290

• Moldovan L., Gaspar A., Toma L., Craciunescu O., Saviuc C., 2010, Comparison of polyphenolic content and antioxidant capacity of five romanian traditional medicinal plants, Revista de Chimie, vol 61, (in press), impact factor  0.552

                Capitol de carte:

• Trif M., Moisei M., Craciunescu O., Chelu F., Zarnescu O., Roseanu A., Moldovan L., 2010, “Lipid-based Nanoparticles as Carriers for Intracellular Drug Delivery” in Nanostructuring and nanocharacterization, series in Micro and Nanoengineering (Coordonatori: M. Zaharescu, Ciurea M., Kleps I., Dascalu D.), Editura Academiei Romane, vol. 16, p. 257-271. ISBN: 978-973-27-1905-3

                Lucrari comunicate si publicate in rezumat

• Trif M., Moisei M., Roseanu A., Zarnescu O., Maris D., Maris M., Craciunescu O., Moldovan L., 2010, Lipid vesicles for effective delivery of anti-inflammatory molecules : development, characterization and performance evaluation, Rom. J. Biochem., 47, Suppl., 26-27, (cotata CNCSIS B), The Annual International Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, 23-25 sept. 2010
• Trif M., Moldovan L., Moisei M., Chelu F., Craciunescu O., Mattsby-Baltzer I., Roseanu A., 2010, Lipid nanostructures as drug delivery system for pharmacological active agents; formulation and in vitro studies, Abstract Addendum, E1.35, p.26, 35^th FEBS Congress Molecules of Life, 26 iun-1 iul 2010, Gothenburg, Suedia