FITODERM

PROGRAMUL 4 – PARTENERIATE IN DOMENIILE PRIORITARE


Denumirea proiectului: OBTINEREA UNUI FITOPRODUS TOPIC EFICIENT IN STIMULAREA PROCESULUI DE VINDECARE A LEZIUNILOR CUTANATE

Acronim: FITODERM

Director de proiect: Dr. Valentina ALEXANDRU (valentinaalexandru@yahoo.com)

Numar de contract: 62071

Durata proiectului: 36 de luni (2008-20011)

Bugetul proiectului: 1.900.000 lei (finantare de la buget)



Rezumatul proiectului:

In contextul utilizarii tot mai frecvente pe plan international si national a produselor naturale in scop farmaco-terapeutic, cercetarile ce se vor efectua in cadrul acestui proiect au ca scop realizarea unui fitoprodus de uz topic avand ca agenti dermatologici extracte vegetale derivate din patru specii de plante medicinale autohtone incluse intr-un suport matriceal de origine animala cu rol in regenerarea tisulara. Pentru atingerea acestui scop, parteneriatul complex interdisciplinar realizat (biologie, chimie, medicina veterinara) a elaborat urmatoarele obiective generale: (1) Investigarea fitochimica a unor specii din flora Romaniei, respectiv jud. Neamt, utilizate in fitoterapia traditionala ca remedii in tratarea ranilor cutanate - Hyssopus officinalis L.(Isop), Achillea millefolium L.(Coada soricelului), Echinaceea purpurea L.(Echinacea), Equisetum arvense L.(Coada calului), (2) Obtinera unui extract optimizat rezultat din amestecul extractelor primare derivate din plantele selectate mentionate si evaluarea eficientei acestuia asupra unor etape din procesul de vindecare, (3) Realizarea, prin asocierea amestecului vegetal cu polimeri matriceali de origine animala, a unui produs eficient in stimularea vindecarii ranilor cutanate. Metodologia ce se va aborda va fi complexa si cuprinde atat metode clasice de analiza, cat si moderne. Pentru analiza fitochimica si standardizarea amestecului vegetal se vor efectua determinari cantitative (spectrofotometrice) si calitative (cromatografie in strat subtire, cromatografie de lichide de inalta performanta - HPLC); pentru obtinerea si caracterizarea fizico-chimica a componentelor matriceale se vor utiliza metode spectrofotometrice, vascozimetrice, electroforetice si cromatografice. Testele in vitro utilizate in cercetarea etnofarmacologica, efectuate pe culturi celulare normale (culturi primare de fibroblaste dermale, linii celulare stabilizate de fibroblaste umane si murine, linie celulara stabilizata de celule endoteliale umane) vor fi abordate atat pentru testarea citotoxicitatii amestecului vegetal si a fitoprodusului, cat si pentru evaluarea activitatilor biologice ale amestecului vegetal asociate cu unele etape din procesul de vindecare (activitatea antioxidanta, activitatea antimicrobiana, stimularea proliferarii, viabilitatii, diferentierii si aderentei fibroblastelor la matricea extracelulara, influenta asupra contractiei latexului de colagen si asupra sintezei de metaloproteinaze matriceale). Pentru demonstrarea eficientei actiunii fitopreparatului asupra procesului de vindecare se vor face teste in vivo pe loturi de animale de laborator cu leziuni tegumentare. Testele in vivo vor fi realizate de medici veterinari cu experienta, cu respectarea stricta a normelor de bioetica si utilizarea unui numar minim de animale. Conceperea acestui fitoprodus va avea grad de noutate, fapt pentru care, pe baza rezultatelor obtinute se va inainta o cerere de brevet de inventie. Realizarea acestui proiect va contribui la dezvoltarea cercetarii romanesti orientata spre valorificarea durabila a resurselor vegetale autohtone in fitoterapie si de asemenea va asigura consolidarea unei pozitii competitive a stiintei romanesti pe plan mondial, ceea ce ne va facilita participarea in viitor la Programul Cadru 7.

Obiectivele generale:

(1) Investigarea fitochimica a unor specii din flora Romaniei, respectiv jud. Neamt, utilizate in fitoterapia traditionala ca remedii in tratarea ranilor cutanate - Hyssopus officinalis L.(Isop), Achillea millefolium L.(Coada soricelului), Echinaceea purpurea L.(Echinacea), Equisetum arvense L.(Coada calului);

(2) Obtinera unui extract optimizat rezultat din amestecul extractelor primare derivate din plantele selectate mentionate si evaluarea eficientei acestuia asupra unor etape din procesul de vindecare;

(3) Realizarea, prin asocierea amestecului vegetal cu polimeri matriceali de origine animala, a unui produs eficient in stimularea vindecarii ranilor cutanate;



Rezultatele finale ale cercetarii din acest proiect vor fi concretizate prin:

1.Obtinerea unui extract vegetal standardizat, imbogatit in substante active cu o structura chimica complexa, lipsit de toxicitate, care are la baza o reteta originala realizata prin asocierea a patru plante medicinale din flora Moldovei utilizate traditional in fitoterapia leziunilor cutanate, asociate si dozate optim.

2. Testarea in vitro a acestui extract va evidentia prezenta activitatilor biologice cu rol in sustinerea si accelerarea procesului de vindecare.

3. Realizarea unui nou fitoprodus prin asocierea extractului vegetal cu un suport structural matriceal de origine animala cu rol in regenerarea tisulara. Produsul va fi biodegradabil, biocompatibil, cu proprietati de stimulare a procesului de vindecare a leziunilor cutanate, cu posibilitati de utilizare in medicina umana si veterinara.

4. Rezultatele stiintifice de excelenta vor fi comunicate si concretizate prin publicarea ca articole in reviste de specialitate cu larga vizibilitate, editarea unei pagini web de prezentare a produselor si intocmirea documentatiei in vederea brevetarii fitoprodusului nou-conceput.


Conducator de proiect: INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE PENTRU STIINTE BIOLOGICE (CO), Splaiul Independentei, Nr. 296, Sector 6, Bucuresti, Cod postal 060031

Componenta consortiului:

Institutul National de C&D pentru Stiinte Biologice (coordonator CO)
Universitatea Bucuresti - Facultatea de Biologie ( partener P1)
Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicina Veterinara Bucuresti - Facultatea de Medicina Veterinara (partener P2)

Autoritatea contractanta: Centrul National de Management Programe - CNMP


Denumirea fazei I/2009: Studiu asupra cunostintelor actuale privind specii utilizate traditional in vindecarea leziunilor cutanate. Teste in vitro si in vivo utilizate in cercetarea etnofarmacologica.

Activitati planificate/realizate si responsabilitatea aferenta fiecarui participant: Activitatea I.1. – Studiul speciilor de Achillea millefolium, Hyssopus officinalis, Echinaceea purpurea si Equisetum arvense din punct de vedere al continutului in substante active de interes pentru procesul de vindecare (CO).

Activitatea I.2. – Selectarea solventilor si metodelor de extractie specifice pentru obtinerea extractelor vegetale (CO).

Activitatea I.3. – Selectarea testelor in vitro ce vor fi utilizate pentru evaluarea activitatilor biologice ale extractelor vegetale (CO si P1).

Activitatea I.4. – Studiu privind teste in vivo utilizate pentru evaluarea procesului de vindecare tisulara (P2).

Activitatea I.5. – Managementul proiectului (CO).

Rezultatele fazei I/2009:

In aceasta prima etapa a proiectului s-a realizat un studiu documentar complex, la care au participat toti partenerii proiectului (CO, P1 si P2). Studiul efectuat a tratat urmatoarele aspecte:

Ø Prezentarea din punct de vedere botanic, a compozitiei chimice si a activitatilor farmacoterapeutice a 4 plante medicinale utilizate traditional in vindecarea ranilor cutanate: Achillea millefolium, Equisetum arvense, Hyssopus officinalis, Echinaceea purpurea.

Ø Evidentierea capacitatii biosintetice a plantelor studiate si a ponderii substantelor active de interes (derivati flavonici, polifenoli, acizi triterpenici, saponozide) continute in extractele vegetale, tilixand diferite metode de extractie si metode de analiza fitochimica cantitativa si calitativa.

Ø Posibilitatea de a evalua citotoxicitatea extractelor vegetale la nivel de celula vegetala prin teste fitobiologice (testul citogenetic, testul de germinare, testul de crestere si testul de cumulare).

Ø Urmarirea prin teste in vitro a actiunii extractelor vegetale asupra procesului vindecarii. Evaluarea prin acest tip de experimente a urmatoarelor activitati biologice implicate in etape din procesul vindecarii: activitatea antimicrobiana, activitatea anti-inflamatoare, proprietatile antioxidante, proliferarea fibroblastelor si keratinocitelor, formarea latexului de colagen.

Ø Teste in vivo, aprobate de comisiile de bioetica prin care poate fi demonstrata accelerarea procesului de vindecare a ranilor tegumentare in urma tratamentului extern cu fitopreparate (creme, geluri, lotiuni).

Ø Datele au fost centralizate si integrate de catre INCDSB, coordonatorul proiectului in raportul intermediar de activitate.


Denumirea fazei II/2009: Evaluarea citotoxicitatii extractelor vegetale primare obtinute din speciile Achillea millefolium, Equisetum arvense, Hyssopus officinalis si Echinaceea purpurea.

Activitati planificate/realizate si responsabilitatea aferenta fiecarui participant:

A 2.1 Obtinerea extractelor primare din speciile vegetale studiate si evaluarea citotoxicitatii acestora. (CO)

Rezultatele fazei II/2009:

Citotoxicitatea extractelor obtinute de la cele 4 specii de plante studiate a fost testata in vitro, pe culturi primare de fibroblaste umane. Aprecierea citotoxicitatii s-a efectuat din punct de vedere morfologic, prin microscopie optica, dupa colorarea celulelor cu hematoxilina–eozina, si indirect, biochimic, prin testul cu rosu neutru. In domeniul de concentratii testate (0,1 - 100µg/ml), s-a observat morfologic, lipsa toxicitatii, iar din punct de vedere al viabilitatii celulare, o stimulare, la concentratii situate intre 50-100 µg/ml la toate cele 4 extracte vegetale testate.

In aceasta etapa a fost supusa analizei din punct de vedere fitochimic populatia naturala de Achillea millefolium, din zona Drguseni, jud. Suceava, care furnizeaza materia prima pentru realizarea fitoprodusului. Analiza efectuata, prin tehnici spectrofotometrice, cromatografie in strat subtire si HPLC, a evidentiat potentialul biosintetic deosebit al acestei populatii in polifenoli, flavonoide, compusi triterpenici si fitosterolici, aspect important care demonstreaza ca populatia de Achillea din Draguseni, este valoroasa din punct de vedere fitochimic.

Denumirea fazei III/2010: Evaluarea fitochimica si antimicrobiana a  speciilor: H. officinalis L., A. millefolium L., E. purpurea L., E. arvense L si utilizarea lor pentru realizarea  unei compozitii vegetale

Activitatea I.2. – Identificarea si determinarea cantitativa si calitativa a substantelor active(CO).

Activitatea I.3. - Evaluarea proprietatilor antibacteriene si antifungice.(P2).

Activitatea I.4. – Realizarea unei  noi compozitii  vegetale pe baza  materialului obtinut din cele 4 specii.Obtinerea mai multor variante de extracte si testarea lor. (CO)

Activitatea I.5. – Managementul proiectului (CO).

Rezultatele fazei III/2010:

In aceasta faza contractuala au fost analizate din punct de vedere fitochimic  patru plante medicinale, Achillea millefolium L. (coada soricelului), Equisetum arvense L. (coada calului), Hyssopus officinalis L.(isop) si Echinaceea purpurea L., utilizate in medicina traditionala din Romania pentru tratarea leziunilor cutanate. Plantele analizate au avut urmatoarea provenienta: Achillea millefolium,  flora spontana (din 3 subpopulatii ale populatiei Radaseni, jud. Neamt), Equisetum arvense,   populatie spontana (comuna I.Creanga, jud Neamt), Echinaceea purpurea, din cultura (CCB Stejarul, jud Neamt) si Hyssopus officinalis , din cultura (2 habitate, SCDA Secuieni si CCB Stejarul, jud Neamt).

            Plantele au fost analizate ca extracte simple si ca tincturi obtinute din amestecul lor cantitativ,  ca solvent s-a folosit alcoolul de concentratie 50% si 70%.

            Extractele simple si tincturile au fost analizate din punct de vedere calitativ  (CSS – cromatografie pe strat subtire) si calitativ-cantitativ (HPLC – cromatografie lichida de inalta performanta si GC-MS – gaz cromatografie cuplata cu spectrometrie de masa).

            Analiza prin CSS  a evidentiat prezenta cu preponderenta a compusilor fenolici  cu efect antioxidant (acid cafeic, acid clorogenic, acid rozmarinic) atat la extractele simple cat si la tincturi.

In urma analizei prin HPLC s-a remarcat ca fiecare specie din compozitia tincturii a cedat un anumit tip de compus, dar in cele doua tincturi s-a  evidentiat  o compozitie mai complexa si completa, comparativ cu extractele obtinute de la fiecare planta. Acest rezultat deosebit demonstreaza ca tincturile realizate au o compozitie complexa si pot fi utilizate pentru alcatuirea unor formule de preparat cu actiune topic cicatrizanta.

Analiza prin GC-MS a uleiurilor volatile a evidentiat la Achillea millefolium, populatia Radaseni 2, fractii volatile importante ca α-pinen 2.25, sabinen/4(10)-tuiona 3.62, 1,8-cineol 3.64, 4-terpineol 2.51, piperitona 5.27, β-cariofilen 5.21, D germacren 4.87 si  chamazulene.

 La Hyssopus officinalis, prin analiza GC-MS, s-a observat  in compozitia uleiului volatil obtinut din  material vegetal provenit din 2 habitate, ca principali componenti, pinocampfona si izopinocampfona. Continutul  poate sa ajunga pana la 53% (suma celor doua fractiuni volatile), astfel: plante cu flori albe „Stejarul” 50,48% / la Secuieni 45,63%, plante cu flori roz „Stejarul” 52,68% / Secuieni 44,58%,  plante cu flori albastre „Stejarul” 54,92% / Secuieni 44,84%. Aceste componente au mare importanta datorita proprietatilor lor cicatrizante, fiind recomandate pentru a  fi incluse in amestecuri care trateaza rani, echimoze, cicatrici. 

Tincturie  au fost testate in vitro pentru evidentierea, activitatilor biologice asociate cu procesul de vindecare tisulara: activitatea antioxidanta, activitatea antimicrobiana si efectul citotoxic asupra  fibroblastelor.

Activitatea antioxidanta s-a determinat printr-o metoda colorimetrica care foloseste radicalul DPPH. Rezultatele acestei testari au demonstrat ca tincturile in care etanolul 70% a fost folosit ca solvent   activitatea  antioxidanta a fost mai mare decat la tincturile in care solventul a fost etanolul 50%. Aceste rezultate se coreleaza cu continutul total in polifenoli, determinat printr-o metoda cantitativa spectrofotometrica. Tincturile care au avut ca solvent etanolul 70% au avut continutul in polifenoli cel mai ridicat.

  Testarea activitatii antimicrobiene s-a efectuat pe bacterii gram + si gram-. Tinctura (solvent EtOH 70%) testata prin metoda difuzimetrica a  demonstrat o activitate antimicrobiana foarte specifica, numai fata de 18 tulpini de Staphiloccocus aureus  implicate in patologia cutanata.

 Efectul citotoxic al tincturilor a fost testat in vitro prin metoda preluarii colorantului rosu neutru. Din fiecare varianta au fost testate 8 concentratii pe culturi de fibroblaste  provenite din linia celulara stabilizata L 929. Rezultatele obtinute dupa 72 de ore de cultivare au evidentiat efectul citotoxic cel mai pronuntat la  concentratii situate peste 250 -500 μg/ml,

Rezultatele obtinute in aceasta faza contractuala recomanda compozitia  realizata de noi, pentru introducerea in formule ale unor preparate topice destinate tratarii unor afectiuni cutanate, datorita continutului complet si complex in substante active cu efect antioxidant, antimicrobian  si cu o citotoxicitate redusa la concentratii situate sub 500 μg/ml.  

Denumirea fazei IV/2011: Evaluare activitatii biologice a variantei de amestec vegetal fitocomplex selectata prin teste in vitro. Realizarea unor variante de produs pentru uz dermatologic. Demonstrarea eficientei produsului obtinut prin teste in vivo.

Activitati planificate/realizate si responsabilitatea aferenta fiecarui participant: Activitatea IV.1. – Testarea activitatilor biologice a variantei de amestec vegetal fitocomplex selectata, pe celule vegetale si pe culturi celulare mamaliene (CO).

Activitatea IV.2. – Valorificarea fitocomplexului sub forma unor variante de produse de uz dermatologic. Asocierea fitocomplexului cu polimeri matriceali, introducerea in diferite baze de unguent, testarea biocompatibilitatii produselor(CO).

Activitatea IV.3. – Teste microbiologice: activitate antimicrobiana si incarcatura microbiana a produselor (P2).

Activitatea IV.4. – Testarea eficientei produselor in vivo pe loturi de animale cu leziuni cutanate (P3).

Activitatea IV.5. – Diseminarea si valorificarea rezultatelor. Intocmirea documentatiei necesara brevetarii rezultatelor originale obtinute ( CO).

Activitatea IV.6. Managementul proiectului (CO).

Rezultatele fazei IV/2011:

In aceasta faza contractuala varianta de fitocomplex selectata in etapa 2010, a fost testata in vitro pentru 2 activitati biologice: pentru efecul citogenetic si citotoxic asupra celulelor vegetale (test fitobiologic), si pentru o activitate asociata cu procesul de vindecare, efectul asupra sintezei de colagen.
Pentru testul fitobiologic s-a analizat compozitia chimica a tincturii obtinute din amestecul de plante care fac obiectul acestui proiect. Extractul obtinut sub forma de tinctura a fost liofilizat si utilizat ulterior pentru evidentierea efectelor citogenetice si citotoxice. Din liofilizat s-au obtinut solutii care s-au utilizat pentru imersia cariopselor de grau. Evaluarea efectelor s-a urmarit pe baza urmatorilor parametrii: frecventa anafazelor si telofazelor, procentul de germinare al cariopselor, testul de cerestere al plantulelor reflectat la nivelul lungimii, radacinilor, tulpinilor si asupra mesei proaspete si uscate a plantulelor. Din punct dr vedere fitobiologic liofilizatul obtinut din tinctura nu induce efecte citotoxice si citogenetice.
Pentru determinarea colagenului sintetizat in vitro, s-a utilizat kitul Sircol (Biocolor Ltd., Newtownabbey, UK) Efectul indus de fitocomplex asupra sintezei de colagen s-a urmarit pe culturi de fibroblaste de soarece, linia L 929. Rezultatele obtinute au evidentiat comparativ cu martorul (celule netratate), stimularea sintezei de colagen in prezenta fitocomplexului la toate concentratiile de fitocomplex testate.
Pentru realizarea produsului de uz topic cu efect in stimularea procesului de vindecare a leziunilor cutanate, a fost testat si introdus in formula, in afara de fitocomplex, colagenul, suport matriceal de origine animala cu rol in regenerarea tisulara. Pentru selectarea colagenului au fost testate, 2 tipuri colagen, nativ si hidrolizat, provenit din 3 surse. Testele s-au efectuat in vitro, pe culturi de fibroblaste, linia L929 (ECACC). Relatia dintre celule si colagen a fost monitorizata prin aprecierea procentului de adeziune si viabilitate celulara pe matrici de colagen. In urma testelor efectuate a fost selectat colagenul hidrolizat care permite o sterilizare simpla si eficienta si ofera o biocompatibilitate ridicata.
Fitocomplexul liofilizat a fost dizolvat in solutia de colagen, iar amestecul a fost introdus intr-o baza de unguent compusa numai din ingrediente naturale cu efect pozitiv in cicatrizarea ranilor cutanate. Fitoprodusul a fost testat atat din punct de vedere al incarcaturii microbiene cat si al eficientei asupra procesului de vindecare al leziunilor cutanate superficiale. Din punct de vedere microbiologic, fitoprodusul testat s-a incadrat in criteriile de acceptabilitate impuse de Farmacopeea Europeana ed. 7/2011. Aprecierea eficientei in vindecarea ranilor a fost efectuata, pe animale mici de laborator, prin comparatie cu o substanta de referinta. Rezultatele obtinute au indicat efectele pozitive ale produsului: cicatrizarea rapida a zonei lezate, vindecarea totala si lipsa reactiilor adverse. Produsul realizat de noi are o formula complexa, este constituit numai din componente naturale si are capacitatea de a stimula procesul de vindecare a tegumentului lezat.

Diseminarea rezultatelor

Aprotosoaie AC, Gille E., Spac A., Necula R., Drutu C., Stanescu U., M. Hancianu, “Influence of planting density on yield and essential oil composition of Hyssopus officinalis L.” Phytochemical Society of Europe (PSE) International Symposium on ''Terpenes-Application, Activity and Analysis'', 26-29.10.2010, Istanbul, TURKEY.

V. Alexandru, R. Tatia, A. Gaspar, E. Gille, V. Coroiu, E.I. Oprita, In vitro Evaluation of four Plants used in traditional medicine fpr wound healing, Romanian Biological Sciences, RBS, vol IX, no. 1-4, 2011, pg.17.

Alexandru V. Necula R. Ghita G., Gaspar A, Toma A., Tatia R., Gille E.,Evaluation of four traditional Romanian medicinal plants as wound healing agents. 59 th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research, 4-9 september, august 2011,Antalya, Turkey. Planta Medica Journal of Medicinal Plant and Natural Products Research, 77(12):1317. (IF 2.369)

Cerere de brevet de inventie
V. Alexandru, E.Gille, R. Necula, F. Leau, S. Savin, R. Tatia, BIOPREPARAT TOPIC, PELICULOGEN CU EFECT PROTECTOR, REGENERATIV SI CICATRIZANT, Cerere de brevet nr. A/00876/ 07.09.2011, OSIM

Datele de contact ale directorului de proiect :

Dr.Valentina Alexandru

Department of Cellular and Molecular Biology
National Institute of Research and Development for Biological Sciences
296,Splaiul Independentei Str., sector 6, Bucharest
Tel +4021-22 0.08.82; Fax: +4021-220.08 82/extension 216
http://www.dbioro.eu