Etapa IV - SANOTOXITEST

“Elaborarea de noi metode si teste de apreciere a sanogenezei carnii de peste pe baza biomarkerilor identificati si metodelor selectionate precum si testarea acestora in vederea validarii”

Obiective planificate si realizate:

1. Urmarirea pe hepatocit a modificarilor de morfologie si structura celulara prin citometrie in flux, in sistem FSC/SSC.
2. Evaluarea pe hepatocit a activitatii esterazice cu Calcein-AM prin citometrie in flux (test de toxicitate celulara).
3. Evidentierea pe hepatocit a fenomenului de apoptoza "in vivo" prin: evidentierea externalizarii de fosfatidilserina cu Annexin-V-FITC/PI.
4. Evaluarea pe hepatocit a activitatii β -galactozidazice prin citometrie in flux.
5. Urmarirea nivelului de glutation redus din ficat, muschi si branhii.
6. Studii histologice la nivelul ficatului, muschiului, branhiilor.
7. Determinarea profilului proteic muscular în functie de expunerea la diferiti agenti poluanti.
8. Evidentierea zimografica a metaloproteinazelor matriceale în muschi.
9. Stabilirea "in vivo" a influentei factorilor poluanti din mediul natural asupra activitatii esterazice determinate prin spectrofotometrie.
10. Determinarea "in vivo"a influentei factorilor poluanti din mediul natural asupra activitatii beta –galactozidazice.
11. Masurarea activitatii Glutation S-transferazei ca enzima indicatoare a functiei de detoxifiere a xenobioticelor in celula sub influenta "in vivo" a factorilor poluanti.
12. Evidentierea pe hepatocit a fenomenului de apoptoza "in vivo" cu Annexin-V-FITC prin microscopie de fluorescenta la pestii prelevati din arii piscicole cu grad diferit de poluare.
13. Evidentierea fragmentarii ADN-ului in cursul fenomenului de apoptoza "in vivo" prin electroforeza conform metodei Comet
14. Identificarea principalilor biomarkeri si elaborarea metodelor de apreciere a sanogenezei pestelui
15. Testarea cu ajutorul noilor metode elaborate a unor esantioane de peste prelevate din zone alese cu grade diferite de poluare.
16. Analiza comparativa a rezultatelor obtinute cu diferitele metode elaborate si corelarea acestora cu indicatorii biologici de poluare din zona si cu compozitia chimica a apei

Rezultate:

Activitatile derulate in parteneriat in aceasta etapa s-au realizat conform cu obiectivele si planul descris si a metodologiei pusa la punct, adaptata si descrisa in celelalte rapoarte tehnico stiintifice avand ca obiectiv major identificarea unor biomarkeri ce pot servi la elaborarea unor teste sensibile de sanogeneza pentru aprecierea calitatii produsului piscicol ca aliment.
Cercetarile intreprinse atat prin citometrie in flux cat si prin tehnici de analiza microscopica optica si electronica de transmisie precum si determinarile unor activitati enzimatice prin spectrometrie pe celule obtinute de la pesti prelevati din ape cu grade de poluare avansata conduc, pe baza concluziilor individuale prezentate la sfarsitul raportului stiintific la concluzia ca exista baze stiintifice fundamentale de identificare a unor biomarkeri ce pot sta la baza elaborarii unor metode sau teste de apreciere a calitatii produsului piscicol ca aliment.
In mod deosebit, se remarca rezultatele obtinute prin citometrie in flux pentru determinarea nivelului de apoptoza hepatica si a viabilitatii celulare cu Calcein-AM, care, prin caracterul statistic si rapiditatea analizei pot deveni cu usurinta teste de rutina pentru aprecierea sanogenezei produselor piscicole.
Determinarea activitatii β-galactozidazice dar si a esterazelor intracelulare, determinate spectrofotometric se pot constitui de asemenea in teste de sanogeneza pentru laboratoarele care nu dispun de un echipament pentru citometrie in flux.
Prezenta etapa a contractului s-a dorit a fi un „screening” al acestor metode puse la punct si testate pe modele experimentale de laborator. In toate cazurile, rezultatele obtinute s-au corelat cu testele clasice de ecotoxicologie si cu alti indicatori biologici de poluare precum si cu compozitia chimica a apei. Rezultatele obtinute, desi pozitive pentru cea mai mare parte dintre aceste metode necesita in continuare studii statistice pentru validarea lor, precum si testarea acestora in conditii diferite de aplicare referitoare la timpul si conditiile de stocare a produsului piscicol inainte de utilizarea acestora. Implementarea utilizarii acestor teste poate contribui de o maniera obiectiva la acordarea certificatului de calitate a produsului piscicol. In plus, metodele elaborate pot conduce la
imaginarea unor “teste”(kituri) rapide si deosebit de sensibile, capabile să deceleze efectul produs de cantitati mult mai fine de agenti poluanti deoarece masoara efectul sinergic per ansamblu al acestora in contextul de degradarii continue a mediului inconjurator sub impactul antropic.