„Evaluarea pe model experimental de laborator a principalelor modificari structurale si functionale induse asupra pestilor prin utilizarea principalilor factori poluanti din mediul natural (concentratii si sinergism de actiune) in vederea evidentierii unor biomarkeri”
Obiective planificate si realizate:
1. Masurarea pe hepatocit, prin citometrie in flux, a stresului oxidativ (ROS) generat de diferitii poluanti.
2. Evaluarea activitatii β – galactozidazice pe hepatocit prin a) citometrie in flux si
b) prin masurarea spectrofotometrica a activitatii β-galactozidazice
3. Investigarea prezentei vitelogenului in sangele masculilor expusi la actiunea poluantilor estrogen-mimetici
4. Urmarirea nivelului de glutation redus din ficat , muschi si branhii
5. Determinarea nivelului de bioacumulare a poluantilor in ficat, muschi si branhii
6. Determinarea profilului proteic muscular in functie de expunerea la diferiti agenti poluanti
7. Evidentierea zimografica a metaloproteinazelor matriceale in muschi
8. Investigarea prin spectrofotometrie a activitatii esterazei pe modelul experimental
9. stabilit, in functie de poluant
10. Masurarea Glutation S-transferazei ca enzima indicatoare a functiei de detoxifiere a xenobioticelor in celula.
11. Investigarea indicelui de supravietuire in laborator a speciilor reprezentative de pesti
12. Evidentierea pe hepatocit a fenomenului de apoptoza “in vivo” cu Annexin –V- FITC prin microscopie de fluorescenta.
13. Evidentierea fragmentarii ADN-ului in cursul fenomenului de apoptoza “in vivo” prin electroforeza conform metodei COMET.
14. Realizarea paginii WEB a proiectului
Rezultate:
Activitatile derulate in parteneriat in aceasta etapa s-au realizat conform cu obiectivele si planul descris si a metodologiei pusa la punct, adaptata si descrisa in celelalte rapoarte tehnico stiintifice, si au avut ca obiectiv major identificarea unor biomarkeri ce pot servi la elaborarea unor teste sensibile de sanogeneza pentru aprecierea calitatii produsului piscicol ca aliment.
• Determinarea speciilor de radicali liberi (ROS) prin citometrie in flux, cu toata sensuibilitatea metodei, pare a nu reusi sa evidentieze un stress oxidativ important care sa poata servi ca test sensibil de sanogeneza
• Expunerea loturilor de peşti (Carassius auratus gibelio) la Lindan şi Deltamethrin a determinat creşterea indicilor gonadosomatic şi hepatosomatic.
• Intoxicaţia acută cu Hyamină a loturilor de crapi a provocat creşterea indicilor hepatosomatic şi gonadosomatic.
• Expunerea carasului Carassius auratus gibelio la pesticidele Lindan, Malathion, Deltamethrin conform modelului experimental prezentat, nu a indus sinteza vitelogeninului la masculii. S-a înregistrat o creştere a cantităţii de proteine totale în foliculii vitelogenici după expunerea peştilor la Lindan.
• Intoxicaţia acută a crapului cu Hyamină a indus o creştere a grupărilor SH totale, atât în muşchiul alb , cât şi în cel roşu, în toate intervalele de expunere studiate. În branhii nivelul grupărilor SH totale este scăzut faţă de martor în primele 48 de ore şi creşte la 96 de ore. În ficat, scăderea înregistrată după 48 de ore este urmată de o creştere semnificativă la 48 de ore şi de o scădere , la valori comparabile cu cele martorului după 96 de ore.
• Nivelul grupărilor SH libere din muşchiul alb, roşu şi branhii a crescut în raport cu martorii de interval la 24, 48 şi 96 de ore. În ficat acest parametru a fost scăzut faţă de martor la 24 şi 48 de ore şi se apropie de valoarea martorului după 96 de ore.
• Nivelul glutationului redus a crescut în extractele de muşchi alb şi roşu în raport cu martorii de interval, a crescut în raport cu martorii , în toate intervalele de expunere în ficat, a fost mai scăzut decât martorul în primele 48 de ore de expunere, dar a crescut la 96 de ore.
• Acumularea ambelor concentraţii de cupru testate, înregistrează o creştere corelată cu intervalul de expunere la poluant.
• Muşchiul roşu a acumulat cantităţi mai mari de metal prin expunerea la concentraţii mai scăzute decât prin expunerea la doze ridicate de cupru.
• Modelul acumulării manganului şi cuprului este asemănător: metalul se acumulează rapid chiar din primele 24 de ore, în timp, înregistrându-se tendinţa de scădere a acestuia.
• Intestinul şi branhiile acumulează cele mai însemnate cantităţi de metal, comparativ cu ficatul, creierul, tegumentul şi muşchiul.
• Prin electroforeza în gel de acril amidă a extractelor proteice totale obţinute din muşchi alb şi roşu, au fost separate peste 23 de forme moleculare. Prin expunerea peştilor la Hyamină s-au observat modificări cantitative ale unor forme moleculare atât în muşchiul roşu cât şi în cel alb.
• Nivelul de activitate al metaloproteinazelor MMP2, MMP9 din muşchiul alb şi roşu de crap au suferit modificări datorate expunerii la Hyamină.
• Determinarea activitatii esterazice cu Calcein-AM, se dovedeste un test extrem de sensibil la actiunea poluantilor, care poate fi retinut ca test de sanogeneza.
• Determinarea activitatii β – galactozidazice atat prin citometrie in flux cat si spectrofotometric a demonstrat o inhibare importanta a nivelulului de activitate sub actiunea poluantilor,putand fi deasemeni retinuta ca posibil test de sanogeneza, ramanand sa fie in etapa urmatoare intens testata.
• Determinarea fenomenului de apoptoza hepatica prin examinare microscopica se dovedeste mai dificil de realizat decat aceeasi analiza prin citometrie in flux, asa cum s-a demonstrat in etapa anterioara, ea putand servi eventual de metoda complementara.
• Testul de apreciere a genotoxicitatii, desi f. sensibil, in conditiile aplicate de noi, este laborios , necesitand un timp lung pentru aprecierea vizuala , in lipsa unui soft de interpretare .
Romana | 
English
