Etapa II/2008

Etapa II/2008: Elaborarea biotehnologiilor de obtinere a MSC si a componentelor organice si anorganice pentru realizarea materialului polimeric compozit

Suma de la buget: 491.357 lei

Obiective planificate si realizate : O2- Selectarea variantelor optime de cultivare a MSC

             O3- Realizarea biotehnologiilor adecvate de preparare a compusilor organici si a materialelor ceramice modificate si caracterizarea acestora in vederea utilizarii in ingineria tisulara

 O4- Obtinerea de noi materiale polimerice compozite de interes biotehnologic

Activitati planificate si realizate:

- Izolarea si caracterizarea MSC (CO, P1, P3)

- Obtinerea componentelor organice si anorganice pentru realizarea materialelor compozite (CO, P2)

- Realizarea tehnologiilor de laborator si obtinerea variantelor de materiale compozite (CO, P2)

- Diseminare rezultatelor. Oportunitati colaborare intern/extern.

- Managementul proiectului.

Rezultate obţinute :

Ø  S-a stabilit o metoda ieftina si productiva de izolare a celulelor stem mezenchimale prin digestia enzimatica a fragmentelor mici de os trabecular. Celulele stem mezenchimale izolate formeaza o populatie heterogena de celule, heterogenitate raportata si de alti autori.

Ø  Unele celule exprima markeri specifici celulelor stem mezenchimale umane de tipul CD133, CD44 (HCAM), CD106 (VCAM), in timp ce altele exprima markeri ai celulelor progenitoare osoase de tipul osteocalcin si osteopontin. Acest comportament sugereaza ca respectivele celule stem mezenchimale au potentialul de a se diferentia in osteoblaste si din acest motiv pot fi folosite in ingineria tisulara osoasa.

Ø  Extractia colagenului in forma nativa din tendon bovin s-a realizat prin doua procedee: chimic (cu solutie diluata de acid acetic) si enzimatic (cu pepsina in mediu acid). In urma analizelor biochimice efectuate s-au determinat puritatea si greutatea moleculara a preparatelor si s-a selectat ca optim procedeul enzimatic. Parametri de extractie si purificare stabiliti au fost: temperatura de extractie 4 ⁰C, concentratia acidului acetic 0,5 M, pH 3,5, raportul pepsina:tesut uscat 1:10.

Ø  In cazul condroitin sulfatului izolat din cartilajul traheal bovin a fost selectata ca optima metoda de extractie chimica, avand un randament mai scazut (76,4 %) comparativ cu cel al metodei enzimatice (80,2 %), dar este mai ieftina si mai putin laborioasa. Selectarea procedeului s-a realizat in urma analizei comparative a caracteristicilor fizico-chimice (acizi uronici, hexozamine, greutate moleculara) si biochimice (gel-electroforeza verticala).

Ø  Prin tehnologia clasică ceramică a fost sintetizat compusul stoechiometric fosfat tricalcic, variaţia polimorfică beta, iar prin tehnica de precipitare chimica din reactivi de inalta puritate s-a obtinut varianta de pulbere TCP nanometrica.

Ø  Pentru evaluarea microstructurala, a morfologiei si compozitiei chimice a pulberilor ceramice au fost realizate studii complexe utilizand aparatura si technici performante precum: DRX, TG/ATD, SEM. Din punct de vedere compoziţional, pulberile şi produsele elaborate prezintă ca fază unică compusul b-Ca₃(PO₄)₂; difractogramele sunt în bună concordanţă cu fişele ASTM. Aspectul  morfologic al pulberii prezinta aglomerari de particule de forme si dimensiuni diferite, bine sinterizate.

Ø  S-a stabilit tehnologia de preparare in laborator a materialului compozit COL-fosfat tricalcic si tehnologia de reticulare a acestuia. Au fost preparate 9 variante de materiale compozite, cu compozitie similara celei din os natural prin integrarea pulberii ceramice in-tr-un gel de COL tip I. In urma analizelor fizico-chimice si biochimice realizate prin metode adaptate noilor produse analizate, s-a selectat ca optima varianta COL:n-TCP 1:1 si procesul de reticulare cu EDC ca fiind eficient. Aceasta metoda nu a mai fost utilizata pentru reticularea unui preparat pe baza de COL destinat ingineriei tisulare osoase.

Ø  Parametri tehnologici pentru realizarea unui compozit optim au fost stabiliti: pulbere ceramica nanocristalina, omogenizare mecanica, temperatura de liofilizare de -35 ⁰C.

Ø  Studiile histochimice de identificare a colagenului, hidroxiapatitei si condroitin sulfatului din bureti au indicat o dispozitie particulara a celor 3 componente. Astfel de studii nu au mai fost raportate in literatura de specialitate si indica faptul ca cele trei componente pot forma biomateriale stabile care pot fi folosite in etapele ulterioare ale proiectului ca suporturi pentru celule.

Ø  Studiile de microscopie electronica au evidentiat ca toate materialele au o structura tridimensionala, poroasa, de tip fagure, cu pori ce variaza ca dimensiune intre 80-350 µm, ceea ce permite infiltrarea celulelor in interiorul acestora.

Ø  Datele au fost centralizate si integrate de catre INCDSB, coordonatorul proiectului, in raportul intermediar de activitate.

Ø  Rezultatele au fost diseminate prin publicarea a 9 lucrari stiintifice dintre care 3 ISI articol si comunicarea a 4 lucrari sub forma de postere la conferinte internationale.