Rezultate

Odata cu integrarea in UE in anul 2007, Romania se va alinia la Standardele Europene in ceea ce priveste asigurarea calitatii nutreturilor cu un impact deosebit asupra sanatatii animalelor si in consecinta a oamenilor, se vor interzice utilizarea pulberilor de origine animala in furajarea animalelor si prin urmare se vor cauta alte cai pentru ca necesarul de proteina furajera sa fie acoperit. In cadrul acestor surse noi de proteina intra:

Utilizarea suplimentelor enzimatice in dieta animalelor este tot mai dinamica prin numeroasele avantaje ce prezinta si anume indepartarea si distrugerea factorilor antinutritionali, conferind o mai buna biodisponibilitate anumitor nutrienti inferiori, reducerea efectului poluant al dejectiilor animaliere si nu in ultimul rand in imbunatatirea calitatii furajelor.
Reziduurile agricole grosiere (paie, coceni de porumb) pe langa faptul ca sunt utilizate in hrana animalelor pentru a asigura cerintele in energie si in substante nutritive, pot fi utilizate si ca surse de carbon in procesele de biosinteza a fungilor.
            Din literatura consultata a rezultat faptul ca majoritatea producatorilor de enzime  hidrolitice utilizeaza tulpini de Aspergillus niger si Trichoderma viride cultivate pe diferite substraturi naturale, in sistem submers sau in culturi de suprafata.
Pe baza datelor de literatura si a experientei colectivului de cercetare s-au testat in vederea obtinerii de tulpini cu activitate polihidrolitica (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze) urmatoarele tulpini existente in colectia de Microorganisme a Facultatii de Biologie-Bucuresti:

Aceste microorganisme au capacitate de a produce in general un complex enzimatic hidrolitic ofera mai multe avantaje fata de sursele de enzima de origine animala sau vegetala, datorita  posibilitatilor de a se dezvolta si produce enzime pe medii de cultura ieftine, in instalatii speciale.
Folosirea microorganismelor ca principala sursa de enzime se datoreaza faptului ca se pot obtine cantitati mari de biomasa in timp relativ scurt si in conditii bine controlate, cat si faptului ca se pot realiza nivele enzimatice crescute prin interventii asupra mediului de cultura si a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismuluiin procesele fermentative fie in sistem submers, fie pe substraturi solide.
In scopul determinarii conditiilor optime pentru biosinteza enzimelor hidrolitice microbiene,  au fost analizati mai multi parametrii care au importanta semnificativa pentru dezvoltarea unei culturi microbiene. Alaturi de tulpina microbiana si compozitia mediului de cultura, printre factorii importanti se numara temperatura, pH-ul mediului de cultura, precum si gradul de agitare a mediului de biosinteza a enzimelor hidrolitice.
Ca urmare, in cadrul proiectului s-au efectuat:

          Tulpina Aspergillus niger CMGB-401 luata in lucru a fost intretinuta prin treceri succesive pe mediu inclinat Czapeck–Dox. Pe mediu Czapeck-Dox si la temperatura optima de dezvoltare de 28°C dupa 7 zile, pe suprafata mediului se formeaza un miceliu bogat alb pufos si un miceliu aerian purtator de conidiofori colorati in negru intens. Miceliul este uniform sporulat pe toata suprafata. Tuburile in care tulpina este dezvoltata corespunzator, se pastreaza in frigider la +4°C - constituind cultura de intretinere.
Lucrarile de laborator au fost efectuate - la nivel de flacoane agitate - in vederea optimizarii mediului de cultura in scopul obtinerii unui nivel cat mai mare al activitatii polienzimatice in mediul de fermentatie. Intr-un bioproces au loc simultan o serie de evenimente complexe influentate de o multime de factori interni si externi: concentratia compusilor din mediul nutritiv si concentratia produsilor biosintezei, pH-ul mediului supus fermentatiei si temperatura acestui mediu, conditiile de aerare si agitare.
           Temperatura mediului in care are loc procesul de biosinteza a enzimelor hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. Variatiile de temperatura au efect asupra randamentului de transformare a substratului in produsul finit, asupra cerintelor nutritive ale microorganismului si compozitia biomasei obtinute si, nu in ultimul rand, asupra vitezei de crestere microbiana.
           Pornind de la aceste considerente teoretice, tulpina luata in lucru, Aspergillus niger CMGB-401 a fost cultivata pe mediul optim de biosinteza folosind o cantitate de 50 mL mediu/ balon de 100 mL, inoculat cu suspensie de spori, durata procesului de fermentatie fiind de 48 ore, iar pentru dezvoltare, culturile au fost mentinute la temperaturi diferite: 28°C, 32°C, 37°C.
Atat pe parcursul biosintezei, cat si in finalul procesului de fermentatie s-a evaluat activitatea enzimatica a complexului extracelular (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze).
           Pentru determinarea pH-ului optim de dezvoltare a fungului Aspergillus niger CMGB-401 s-au efectuat experimente de biosinteza a complexului enzimatic, in intervalul de pH=5-7,5, timp de 48 de ore, la 28°C; s-a urmarit evolutia bioprocesului prin determinarea activitatilor enzimatice (amilaze, proteaze, celulaze, xilanaze) in conditiile metodelor de analiza, stabilite in prima etapa.
           In ceea ce priveste influenta gradului de agitare asupra procesului de biosinteza a tulpinii Aspergillus niger experimentele s-au realizat cu ajutorul unui agitator rotativ, mediul de biosinteza insamantat a fost pus in 2 flacoane Erlenmayer de 100 mL cu cate 50 mL/flacon si s-a urmarit influenta gradului de agitare dupa 48 ore de cultivare la 50, 100, 220, 250 r.p.m.. comparativ cu o proba martor neagitata.
           Indiferent de localizarea produselor de biosinteza intra- sau extracelular, prima etapa de prelucrare post-biosinteza a mediilor de fermentatie consta in separarea biomasei. Datorita volumelor mari, a vascozitatii relativ mari si a filtrabilitatii de obicei reduse a mediilor de cultura, in procesele industriale de obtinere a enzimelor hidrolitice de biosinteza se folosesc tehnici de filtrare speciale (filtre rotative cu suprafata mare).
           Pentru a reduce pierderile de substanta activa prin denaturare termica, mediile de cultura se racesc la 5-10°C si apoi se pregatesc pentru filtrare.
           S-au testat urmatoarele variante de izolare si caracterizare a produsului polienzimatic obtinut prin cultivarea tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediile de cultura luate in lucru:

           O prima varianta a fost prelucrarea integrala a mediului de fermentatie final (50 mL) inainte de sporulare prin adsorbtie pe CaCO3 (5 g) in curent de aer, la temperatura de 37°C, timp de 2 ore rezultand un preparat polienzimatic brut care a fost analizat ulterior.
           Procesul de filtrare al masei celulare este legat in majoritatea cazurilor de dificultati tehnologice. Centrifugarea se realizeaza cu ajutorul separatoarelor centrifugale de turatie mare de (4000 - 5000 r.p.m.).
           S-a experimentat astfel obtinerea preparatului polienzimatic cu activitate hidrolitica superioara din Aspergillus niger in bioreactor de 4 litri.
     Linia de lucru stabilita la nivel de micropilot cuprinde urmatoarele etape:

          S-au definitivat metodele de dozare a activitatii hidrolitice a preparatului enzimatic din Aspergillus niger in vederea obtinerii de date reproductibile pentru activitatea amilolitica, celulozolitica, proteolitica si xilanazica.
     Rezultatele obtinute au permis alegerea temperaturii optime de cultivare, temperatura la care activitatea celor 4 enzime din complex se situeaza la valori ridicate, aceasta fiind de 280 C. In ceea ce priveste valoarea optima a pH-ului a fost de 5,5. De asemenea, agitarea optima a fost de 220 r.p.m,, comparativ cu proba martor unde s-a constat sporularea microorganismului, lucru recomandabil in cazul obtinerii de preparate furajere intrucat prelucarea integrala prin absorbtie pe carbonat de calciu a mediului de fermentatie dupa 48 de ore a fost abandonata; se observa o scadere semnificativa a activitatilor enzimatice datorita probabil denaturarii  termice a enzimelor hidrolitice obtinute.
     La nivel de bioreactor activitatile enzimatice ale  produsului polienzimatic, dupa 48 de ore au fost urmatoarele:

          Ulterior, mediul de fermentatie, dupa 48 de ore a fost supus proceselor de izolare si caracterizare a enzimelor hidrolitice, iar produsul polienzimatic obtinut prin filtrare, concentrare si adsorbtie pe CaCO3 prezinta urmatoarele activitati enzimatice:

    Pentru imbunatatirea calitatii produsului enzimatic cu activitate xilanazica, amilolitica, proteolitica si celulozolitica obtinut din culturi de Aspergilus niger CMGB-401, sarja pilot, s-a testat tehnica imobilizarii pe diferite suporturi utilizind metoda includerii in gel de: gelatina, chitosan, colagen si deshidratare prin uscare si adsorbtie fizica pe zeolit.

    S-a observat ca activitatea xilanazica, amilolitica si celulozolitica este mai ridicata pentru probele in care s-a inhibat activitatea proteolitica. In lipsa acesteia reticularea este mai buna.

In varianta de imobilizare prin adsorbtie fizica pe zeolit, varianta adoptata in final pentru conditionarea produsului polienzimatic obtinut in cantitate de 1,3 kg in urma reunirii concentratului mediului de fermentatie de la 4 sarje, rezultatele obtinute au fost urmatoarele:

Tabel 2. Determinarea activitatii amilolitice, proteolitice, celulozolitice si xilanazice. pentru complexul imobilizat pe zeolit.

Stabilitatea produsului polienzimatic este prezentata in tabelul nr. 3.
Tabel nr. 3 Stabilitatea in timp a preparatului enzimatic imobilizat prin adsorbtie fizica.

Se observa ca dupa 5 luni de depozitare la temperatura de 40CC, preparatul polienzimatic imobilizat prin adsorbtie fizica pe zeolit prezinta o activitate relativa de peste 70 % din activitate initiala.
Preparatul obtinut a fost testat pe un lot de suine la IBNA-Balotesti.
Rezultatele au indicat faptul ca este biocompatibil si bine tolerat de animale prin testele hematologice efectuate prin tehnica citometriei in flux fata de un lot martor.